Dos fármacos reutilizados inhiben los factores de entrada del SARS-CoV-2 de forma sinérgica


La búsqueda de medicamentos seguros y eficaces para contrarrestar el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ha estado en marcha desde que la primera ola mostró los efectos devastadores del virus en una minoría significativa de los infectados.

Un papel preimpreso cargado en el bioRxiv* servidor muestra cómo la combinación de medicamentos dirigidos a diferentes factores de entrada de la célula huésped puede prevenir la infección por el virus.

Estudio: inhibición sinérgica de dos factores del huésped que facilitan la entrada del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo. Crédito de la imagen: Kateryna Kon / Shutterstock

Dianas de proteasa dual

El virus SARS-CoV-2 ataca a su célula huésped a través de varias vías diferentes. El más conocido involucra a la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2), el receptor en la célula huésped, al cual el virus proteína de pico se adhiere. Esto desencadena un cambio conformacional masivo que hace que la membrana viral se fusione con la célula huésped.

Esta fusión facilita la entrada viral en el citoplasma de la célula huésped a través del tráfico endosómico. Sin embargo, para que la proteína de pico haga esto, debe estar preparada por una enzima proteasa del huésped, como TMPRSS2, o por catepsinas, durante el proceso de endocitosis.

La catepsina se localiza principalmente en los endosomas tardíos o lisosomas, con una actividad óptima a un pH ácido, lo que ha llevado al postulado de que la entrada del virus es a través del compartimento endolisosómico. Por el contrario, TMPRSS2 es una enzima de la superficie celular y funciona en un rango de niveles de pH, lo que indica que escinde la proteína de pico de las partículas virales en la membrana plasmática, lo que facilita la entrada del virus.

Al comienzo de la pandemia, se descubrió que el inhibidor de catepsina E-64 y el inhibidor de TMPRSS2 camostat mesilato bloquearon la infección por SARS-CoV-2. Sin embargo, su baja afinidad de unión por las proteasas las hizo inelegibles para ensayos clínicos.

Otro inhibidor de TMPRSS2, el mesilato de nafamostat, tiene una alta afinidad nanomolar por la enzima.

Apilimod inhibe los endosomas tardíos

Mientras tanto, se demostró que un medicamento llamado apilimod inhibe otra enzima involucrada en el tráfico endosomal, evitando la entrada viral, aunque su mecanismo de acción no está claro.

Esta enzima, llamada quinasa PIKfyve, es necesaria para generar una molécula clave que contiene fosfato que regula muchas proteínas que participan en el tráfico viral endosómico tardío. La inhibición de esta enzima conduce a la prevención de la infección por Ébola, Marburg y SARS-CoV-2, como se ha demostrado en estudios anteriores.

La quinasa PIKfyve puede regular los niveles de catepsina en el endosoma porque todas las células en las que E-64 inhibió la entrada viral al bloquear el cebado de la espiga mediado por la catepsina también fueron sensibles al inhibidor de la quinasa PIKfyve apilimod, mientras que aquellas que fueron resistentes al primero tampoco lo lograron. mostrar inhibición con el segundo.

Combinación sinérgica de inhibidores

La infección por SARS-CoV-2 está mediada por dos vías de proteasa que se complementan entre sí, una que depende de la catepsina y la otra de TMPRSS2 para preparar la proteína espiga para la fusión. Las líneas celulares que expresaban TMPRSS2 pero no respondían a la inhibición de la catepsina eran completamente sensibles a los inhibidores de TMPRSS2.

El estudio actual probó diferentes células con diferentes niveles de estas proteasas, utilizando diferentes combinaciones de inhibidores de proteasa con apilimod, para evaluar cómo cada una inhibía un pseudovirus que expresaba la proteína pico SARS-CoV-2.

Los inhibidores de proteasa E-64, apilimod, mesilato de camostat o mesilato de nafamostat previenen la infección por VSV-SARS-CoV-2 pero no por VSV.  (A) Esquema del ensayo de infectividad para células pretratadas durante 1 ho no con los inhibidores, posteriormente infectadas con VSV-SARS-CoV-2 durante 1 h en presencia o ausencia de inhibidores.  Las células se incubaron durante otras 7 h en presencia o ausencia de inhibidores y luego se fijaron;  el porcentaje de células que expresan eGFP medido por microscopía confocal de disco giratorio.  (BF) Cuantificación del número de células infectadas de tres experimentos independientes, cada uno determinado a partir de 5 campos de visión que contienen 80-200 células por experimento (las barras de error muestran SEM) para los tipos de células indicados.  Las células infectadas Vero (B) o Vero + TMPRSS2 C) se analizaron 8 hpi usando 0,5 µg / ml de ARN de VSV-SARS-CoV-2.  Las células infectadas Caco-2 (D) o Calu-3 (E) se analizaron 8 hpi usando 5 µg / ml de ARN de VSV-SARS-CoV-2.  Las células infectadas con 0,075 µg / ml de ARN de VSV (F) se analizaron 6 hpi.  En cada caso, estas concentraciones de virus y condiciones de infección correspondieron a una MOI de ~ 0,5.

Los inhibidores de proteasa E-64, apilimod, mesilato de camostat o mesilato de nafamostat previenen la infección por VSV-SARS-CoV-2 pero no por VSV. (A) Esquema del ensayo de infectividad para células pretratadas durante 1 ho no con los inhibidores, posteriormente infectadas con VSV-SARS-CoV-2 durante 1 h en presencia o ausencia de inhibidores. Las células se incubaron durante otras 7 h en presencia o ausencia de inhibidores y luego se fijaron; el porcentaje de células que expresan eGFP medido por microscopía confocal de disco giratorio. (BF) Cuantificación del número de células infectadas de tres experimentos independientes, cada uno determinado a partir de 5 campos de visión que contienen 80-200 células por experimento (las barras de error muestran SEM) para los tipos de células indicados. Las células infectadas Vero (B) o Vero + TMPRSS2 C) se analizaron 8 hpi usando 0,5 µg / ml de ARN de VSV-SARS-CoV-2. Las células infectadas Caco-2 (D) o Calu-3 (E) se analizaron 8 hpi usando 5 µg / ml de ARN de VSV-SARS-CoV-2. Las células infectadas con 0,075 µg / ml de ARN de VSV (F) se analizaron 6 hpi. En cada caso, estas concentraciones de virus y condiciones de infección correspondieron a una MOI de ~ 0,5.

A las concentraciones utilizadas, no se observó citotoxicidad.

Se encontró que las combinaciones de inhibidores de la proteasa con apilimod muestran un aumento sorprendente en la eficacia de la inhibición, indicando sinergismo en lugar de simples efectos aditivos.

El uso de apilimod y mesilato de camostat redujo la concentración efectiva al 50% (CE50) de este último dos veces contra el SARS-CoV-2, mientras que en las células que carecen de catepsina, la CE50 disminuyó cinco veces. Una combinación de apilimod y mesilato de nafamostat redujo la CE50 20 veces.

Con concentraciones más altas de mesilato de nafamostat, la combinación condujo a una reducción de diez veces en la CE50 de apilimod. La combinación fue igualmente sinérgica contra los pseudovirus que expresan la variante de pico D614G, que se sabe que es más infecciosa.

Este fuerte sinergismo fue causado por la inhibición tanto de TMPRSS2 como de la enzima endosomal PIKfyve quinasa, por mesilato de nafamostat y apilimod, respectivamente, ambos a concentraciones nanomolares.

Un virus de control que no requiere ninguna de estas enzimas para entrar pudo infectar estas líneas celulares, como se esperaba.

La combinación de inhibidores de estas dos enzimas también previno la infección por SARS-CoV-2, con un sinergismo igualmente fuerte.

¿Cuáles son las implicaciones?

Apilimod bloquea el tráfico viral endosómico tardío y también inhibe la entrada viral mediada por catepsina en las células a través de endosomas tardíos. Los inhibidores de TMPRSS2 previenen la infección viral mediada por TMPRSS2.

La combinación de estos inhibidores, que actúan contra dos factores de entrada virales diferentes, generó una intensa actividad sinérgica contra la entrada del SARS-CoV-2 en las células huésped diana, en comparación con el uso de cualquiera de ellos de forma aislada. Esto contrasta con los efectos aditivos observados con el uso combinado de inhibidores de catepsina con inhibidores de TMPRSS2 para bloquear la infección por SARS-CoV-2.

Tal inhibición estaba presente tanto contra un pseudovirus que expresaba la proteína de pico del SARS-CoV-2 como contra el propio virus del SARS-CoV-2.

Las versiones modificadas de estos inhibidores con una mayor biodisponibilidad oral se encuentran actualmente en ensayos clínicos y se utilizan solos para tratar diversas afecciones, incluido el COVID-19. Se están probando formulaciones intravenosas de mesilato de nafamostat, con mayor solubilidad, para la terapia con COVID-19.

Se supone, con base en el sinergismo observado en este estudio, que el uso de inhibidores de PIKfyve y TMPRSS2 en combinación podría aumentar la eficiencia de la inhibición viral de 5 a 10 veces en las células huésped, lo que marca un avance en el tratamiento de COVID-19.

*Noticia importante

bioRxiv publica informes científicos preliminares que no son revisados ​​por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, guiar la práctica clínica / comportamiento relacionado con la salud o tratarse como información establecida.

.



Source link