El ensayo digital CRISPR de inicio en caliente permite una detección cuantitativa sensible de SARS-CoV-2 en muestras clínicas

[ad_1]

En una reciente medRxiv* papel preimpreso, investigadores del Centro de salud de la Universidad de Connecticut en los Estados Unidos presentan su método digital CRISPR de inicio en caliente (WS-CRISPR) para la detección cuantitativa estricta y sensible del síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) en muestras clínicas de pacientes con enfermedad por coronavirus (COVID-19) ).

Dado que el tratamiento antiviral eficaz y las vacunas COVID-19 totalmente validadas no están disponibles hasta ahora en nuestra batalla contra COVID-19, la cuantificación precisa y exacta del virus SARS-CoV-2 juega un papel fundamental en la evaluación de los parámetros de infectividad y el control de la pandemia en curso.

Para cuantificar el SARS-CoV-2, la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa basada en sondas (RT-PCR) se utiliza actualmente como técnica estándar de oro debido a su sensibilidad y especificidad relativamente altas; no obstante, depende de instrumentos costosos y sondas bien diseñadas que no son aptas para clínicas pequeñas o entornos de salud comunitaria.

Asimismo, los métodos de amplificación isotérmica están realmente pensados ​​para fines de detección cualitativa o se exponen con frecuencia a una amplificación no específica no deseada o señales positivas falsas.

Aquí es donde entra en juego la detección de ácidos nucleicos basada en CRISPR-Cas. Aún así, la pregunta es si se puede modificar para permitir una cuantificación precisa sin una amplificación del objetivo prematura no deseada y una sobreestimación posterior si se utiliza la detección digital.

Un grupo de investigación de los Estados Unidos, dirigido por el Dr. Xiong Ding, del Departamento de Ingeniería Biomédica del Centro de Salud de la Universidad de Connecticut en Farmington, describió un ensayo digital WS-CRISPR que promete una cuantificación válida y confiable de los compuestos nucleicos del SARS-CoV-2. ácidos en muestras clínicas.

Descripción general del ensayo digital WS-CRISPR.  a, La mezcla de reacción WS-CRISPR de un recipiente se prepara primero en un tubo.  Después de distribuirlos en el chip digital QuantStudio 3D, se aíslan en micropocillos más de diez mil microrreacciones de subnanolitros (~ 0,7 nL).  Cuando se incuba a 52 ° C, cada microrreacción con la diana de ARN del SARS-CoV-2 emprende una reacción WS-CRISPR y genera una fuerte fluorescencia verde (puntos positivos), mientras que no en aquellos sin diana (puntos negativos).  La barra de escala es de 300 μm.  Mediante la detección y el recuento de las microrreacciones positivas (o manchas), se puede cuantificar el ARN del SARS-CoV-2 en función de la proporción de manchas positivas.  b, Principio de funcionamiento del ensayo WS-CRISPR de un solo recipiente para la detección del SARS-CoV-2.  La mezcla de reacción WSCRISPR contiene el complejo Cas12a-crRNA, seis cebadores DAMP (dos cebadores externos de FO y RO, dos cebadores internos de FI y RI, y dos cebadores de competencia de FC y RC), reportero ssDNA-FQ, transcriptasa inversa SuperScript IV, Bst ADN polimerasa y ARN de SARS-CoV-2 en un formato de un solo recipiente.

Descripción general del ensayo digital WS-CRISPR. a, La mezcla de reacción WS-CRISPR de un recipiente se prepara primero en un tubo. Después de distribuirlas en el chip digital QuantStudio 3D, se aíslan en micropocillos más de diez mil microrreacciones de subnanolitros (~ 0,7 nL). Cuando se incuba a 52 ° C, cada microrreacción con la diana de ARN del SARS-CoV-2 emprende una reacción WS-CRISPR y genera una fuerte fluorescencia verde (puntos positivos), mientras que no en aquellos sin diana (puntos negativos). La barra de escala es de 300 μm. Mediante la detección y el recuento de las microrreacciones positivas (o manchas), se puede cuantificar el ARN del SARS-CoV-2 en función de la proporción de manchas positivas. b, Principio de funcionamiento del ensayo WS-CRISPR de un solo recipiente para la detección del SARS-CoV-2. La mezcla de reacción WSCRISPR contiene el complejo Cas12a-crRNA, seis cebadores DAMP (dos cebadores externos de FO y RO, dos cebadores internos de FI y RI, y dos cebadores de competencia de FC y RC), reportero ssDNA-FQ, transcriptasa inversa SuperScript IV, Bst ADN polimerasa y ARN de SARS-CoV-2 en un formato de un solo recipiente.

Bloques de construcción del nuevo método

En este emocionante esfuerzo científico, los investigadores aprovecharon una reacción CRISPR de inicio en caliente de un solo recipiente inaugural, que combina una amplificación isotérmica mediada por cebado dual de transcripción inversa a baja temperatura (RT-DAMP) y detección basada en CRISPR-Cas12a.

Más específicamente, para acoplar estos dos sistemas de reacción diferentes en un solo recipiente, se ha añadido pirofosfatasa para mantener una concentración constante de iones de magnesio degradando el subproducto pirofosfato de magnesio.

Además, se han utilizado cebadores internos fosforotioados para permitir una amplificación isotérmica de transcripción inversa eficiente a temperaturas bastante bajas (como 52 ° C) en este estudio.

Finalmente, al dividir la mezcla de reacción de un solo recipiente en microrreacciones de sub-nanolitros utilizando chips digitales QuantStudio 3D, este grupo de investigación desarrolló un ensayo CRISPR digital que permite una cuantificación sensible y confiable de SARS-CoV-2.

Moviendo la portería de los diagnósticos CRISPR

En comparación con las técnicas de ácido nucleico basadas en CRISPR informadas anteriormente, este ensayo digital WS-CRISPR ofrece varias ventajas excepcionales. En primer lugar, esta es una demostración inaugural de un ensayo CRISPR de un solo recipiente que combina Bacillus stearothermophilus (Bst) Amplificación isotérmica de transcripción inversa basada en ADN polimerasa con detección CRISPR-Cas12a, sin la necesidad de una temperatura de reacción más alta y ácidos nucleicos más largos.

Además, el método generalmente se inicia a una temperatura elevada (por encima de 50 ° C), abordando el problema de la amplificación del objetivo prematura no deseada en la detección digital, además de mostrar una sensibilidad 10 veces mayor y una alta especificidad de detección en comparación con el volumen basado en tubos. formato de ensayo.

Al dirigirse al gen de la nucleoproteína de SARS-CoV-2, es posible cuantificar tan solo 5 copias de ARN de SARS-CoV-2 por microlitro en el chip con el uso del ensayo digital WS-CRISPR. Además, la cuantificación puede ocurrir en muestras clínicas, lo que permite evaluar la infectividad de COVID-19 y el fármaco antiviral. eficacia.

Finalmente, el ensayo digital WS-CRISPR propuesto muestra un alto nivel de tolerancia a los inhibidores y se puede utilizar para detectar directamente el virus en muestras de saliva cruda, evitando la necesidad de extracción de ARN. Esto, a su vez, facilitará el diagnóstico de COVID-19 y reducirá el riesgo de infección en los trabajadores de la salud.

Un vistazo al futuro

“Como el primer ensayo CRISPR digital clínicamente validado, nuestro ensayo digital WS-CRISPR proporciona una detección cuantitativa de SARS-CoV-2 confiable, sensible y sencilla”, enfatizan los investigadores del estudio en este medRxiv papel de preimpresión. “Abre una nueva exploración para la detección cuantitativa de ácidos nucleicos basados ​​en CRISPR”, añaden.

Detección directa de SARS-CoV-2 en muestras de saliva cruda mediante ensayo digital WS-CRISPR.  a, Flujo de trabajo para pruebas directas de SARS-CoV-2 en muestras de saliva enriquecidas mediante ensayo digital WS-CRISPR.  b, Micrografías de fluorescencia de punto final del chip para la detección directa del virus SARS-CoV-2 enriquecido en muestras de saliva.  Muestras de saliva 1-5, las muestras con 10%, 5%, 2.5%, 1% y 0% de virus SARS-CoV-2 inactivado por calor.  Cada micrografía es un representante de seis regiones distintas tomadas para cubrir aproximadamente 2809 microrreacciones.  PC, muestra de control positivo para SARS-CoV-2.  NC, muestra de control negativo para SARS-CoV-2.  NTC, control sin plantilla.  Las barras de escala son de 300 μm.

Detección directa de SARS-CoV-2 en muestras de saliva cruda mediante ensayo digital WS-CRISPR. a, Flujo de trabajo para pruebas directas de SARS-CoV-2 en muestras de saliva enriquecidas mediante ensayo digital WS-CRISPR. b, Micrografías de fluorescencia de punto final del chip para la detección directa del virus SARS-CoV-2 enriquecido en muestras de saliva. Muestras de saliva 1-5, las muestras con 10%, 5%, 2.5%, 1% y 0% de virus SARS-CoV-2 inactivado por calor. Cada micrografía es un representante de seis regiones distintas tomadas para cubrir aproximadamente 2809 microrreacciones. PC, muestra de control positivo para SARS-CoV-2. NC, muestra de control negativo para SARS-CoV-2. NTC, control sin plantilla. Las barras de escala son de 300 μm.

A pesar de las ventajas anteriores, un nuevo chip digital debe explorarse y validarse más a fondo para el ensayo digital WS-CRISPR en el futuro, con la necesidad de pasos de validación clínica adicionales.

Además, aunque este ensayo digital WS-CRISPR utiliza microscopía de fluorescencia relativamente cara para fines de obtención de imágenes, la microscopía de fluorescencia portátil basada en teléfonos inteligentes puede convertirse en la opción alternativa para la detección cuantitativa in situ en un futuro próximo.

*Noticia importante

medRxiv publica informes científicos preliminares que no son revisados ​​por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, guiar la práctica clínica / comportamiento relacionado con la salud o tratarse como información establecida.

.

[ad_2]

Source link