El uso de la visualización de la superficie de células de mamíferos para la caracterización rápida de variantes del SARS-CoV-2


Un grupo de investigación de los EE. UU. Demostró la practicidad de un sistema de visualización de picos para acelerar el diseño de vacunas, pero también para evaluar rápidamente los efectos de las mutaciones en cepas emergentes del síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Sus resultados están actualmente disponibles en el bioRxiv* servidor de preimpresión.

El SARS-CoV-2, el agente causante de la enfermedad por coronavirus en curso (COVID-19), utiliza su glicoproteína de pico para interactuar con la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) para fusionar la membrana celular y la envoltura viral. El determinante clave del tropismo del huésped es la subunidad S1 de la glicoproteína de pico, compuesta por el dominio de unión al receptor (RBD) y el dominio N-terminal (NTD).

Como resultado, la respuesta inmune humoral a la glicoproteína de pico representa la forma más sólida de abordar la infección por SARS-CoV-2. Y las vacunas actuales de hecho provocan una potente respuesta de anticuerpos policlonales al administrar esos ‘picos’ a través de la inmunización.

Estudio: Caracterización rápida de variantes de picos a través de la visualización de la superficie de células de mamíferos.  Haber de imagen: Design_Cells / Shutterstock

Variantes emergentes del SARS-CoV-2 que son motivo de preocupación

Sin embargo, la glicoproteína de pico tiende a recombinarse y mutar, lo que da como resultado el surgimiento de nuevas variantes para la selección inmunogénica. En consecuencia, múltiples variantes preocupantes han aumentado la transmisibilidad viral y el escape de anticuerpos, mientras que muchas variantes con mutaciones de pico compuestas se han extendido desde la aparición de una mutación D614G bien conocida y globalmente dominante.

Más específicamente, los linajes B.1.1.7 (Reino Unido), B.1.1.248 (Brasil), B.1.351 (Sudáfrica) y B.1.427 / B.1.429 (California) son especialmente preocupantes ya que pueden esquivar parcialmente sueros de convalecencia, anticuerpos monoclonales e inmunidad humoral inducida por vacunas.

Pero, ¿cómo caracterizar estos picos? glucoproteínas de diversas familias de coronavirus? Una plataforma rápida y de alto rendimiento que se ha establecido recientemente es la denominada visualización de picos, donde se ensamblan variantes complejas de picos a través de un marco de clonación Golden Gate, apto para clonación manual y automatizada robóticamente.

En este nuevo artículo, un grupo de investigación de Texas (dirigido por el Dr. Kamyab Javanmardi de la Universidad de Texas en Austin, EE. UU.) Evaluó aproximadamente 200 picos de SARS-CoV-2 variantes para su expresión, unión a ACE2 y reconocimiento posterior por trece anticuerpos neutralizantes.

Enfoque metodológico

En este estudio, los investigadores expresaron inicialmente el ectodominio de pico de SARS-CoV-2 en la superficie de las células del riñón embrionario humano (HEK293T) que se utilizan comúnmente en experimentos como estos. Luego, evaluaron la expresión de picos y la antigenicidad utilizando citometría de flujo.

En el aspecto metodológicamente clave del estudio, las variantes de glicoproteína de pico de SARS-CoV-2 y los homólogos de pico afines se construyeron rápidamente a través del ensamblaje Golden Gate a partir de piezas estandarizadas y manejo de líquidos acústicos.

Este grupo de estudio también ha medido la afinidad de unión a ACE2 de los picos mostrados en la superficie mediante el uso de anticuerpos secundarios fluorescentes no reactivos cruzados dirigidos contra el fragmento Fc de anticuerpo humano (unión a ACE2) y de ratón.

Escapar de los anticuerpos neutralizantes

Este estudio destacó una clase pública de epítopos en los bucles N3 y N5 de NTD de SARS-CoV-2 que son reconocidos por la mayoría de los anticuerpos neutralizantes que se unen a NTD que se analizaron. Aunque algunas sustituciones clínicas de NTD pueden revertir el proceso de unión a estos epítopos, se encuentran en frecuencias muy bajas en todo el mundo.

Además, las mutaciones de NTD en las variantes virales de interés mencionadas anteriormente impactan en la expresión de los picos y escapan a la mayoría de los anticuerpos neutralizantes dirigidos a NTD. No obstante, dos clases de anticuerpos NTD todavía pueden unirse a los picos de B.1.1.7 y transmitir la neutralización en los ensayos pseudovirales.

También se observó que las variantes brasileñas y sudafricanas incluyen mutaciones compensatorias que pueden aumentar la expresión de picos o la afinidad de unión. Finalmente, ambas variantes pueden escapar por completo de un potente imitador del péptido ACE2.

Caracterización biofísica de picos mostrados en células humanas.  (a) Los ectodominios de pico se muestran en la superficie de las células HEK293T.  Una tubería de clonación automatizada se combina con citometría de flujo para permitir un cribado de alto rendimiento.  La caracterización biofísica se realiza con picos cortados de las superficies celulares.  (b) La inmunotinción confirma que los picos de SARS-CoV-2 (6P-D614G) están localizados en las membranas celulares y se unen a ACE2, REGN10933 o 4A8.  Barra de escala: 10 μm.  (c) Micrografía de microscopía electrónica de tinción negativa (izquierda), promedios de clase 2D (centro) y un modelo 3D de picos mostrados en la superficie en la conformación previa a la fusión.  La mayoría de las partículas muestran una configuración de 1-RBD hacia arriba.  Barra de escala: 100 nm (d) La señal de visualización de picos relativos se correlaciona con los niveles de expresión de picos recombinantes para variantes de picos clínicos y de ingeniería24,37.  Para ambos ejes, la señal se normaliza a la expresión spike-2P.  La correlación de Pearson se utiliza para el análisis estadístico.  (e) Unión del dominio soluble de ACE2 por diversos picos de la familia de coronavirus mostrados en las superficies de las células de mamíferos.  (f) Se midió la unión normalizada para los anticuerpos neutralizantes RBD- (REGN10987), NTD- (4A8) y S1 (2-43) dirigidos usando el pico completo de SARS-CoV-2 o el RBD aislado.  (g) Titulación de nAb de unión a NTD mediante visualización de picos y citometría de flujo.  (h) Titulación de nAbs ACE2, dirigidos por RBD (REGN10933 y REGN10987) y dirigidos por S1 (2-43) usando visualización de picos y citometría de flujo.  Todas las medidas en (EH) son un promedio de tres réplicas biológicas.  Barras de error: SD

Caracterización biofísica de picos mostrados en células humanas. (a) Los ectodominios de pico se muestran en la superficie de las células HEK293T. Una tubería de clonación automatizada se combina con citometría de flujo para permitir un cribado de alto rendimiento. La caracterización biofísica se realiza con picos cortados de las superficies celulares. (b) La inmunotinción confirma que los picos de SARS-CoV-2 (6P-D614G) están localizados en las membranas celulares y se unen a ACE2, REGN10933 o 4A8. Barra de escala: 10 μm. (c) Micrografía de microscopía electrónica de tinción negativa (izquierda), promedios de clase 2D (centro) y un modelo 3D de picos mostrados en la superficie en la conformación previa a la fusión. La mayoría de las partículas muestran una configuración de 1-RBD hacia arriba. Barra de escala: 100 nm (d) La señal de visualización de picos relativos se correlaciona con los niveles de expresión de picos recombinantes para variantes de picos clínicos y de ingeniería24,37. Para ambos ejes, la señal se normaliza a la expresión spike-2P. La correlación de Pearson se utiliza para el análisis estadístico. (e) Unión del dominio soluble de ACE2 por diversos picos de la familia de coronavirus mostrados en las superficies de las células de mamíferos. (f) Se midió la unión normalizada para los anticuerpos neutralizantes RBD- (REGN10987), NTD- (4A8) y S1 (2-43) dirigidos usando el pico completo de SARS-CoV-2 o el RBD aislado. (g) Titulación de nAb de unión a NTD mediante visualización de picos y citometría de flujo. (h) Titulación de nAbs ACE2, dirigidos por RBD (REGN10933 y REGN10987) y dirigidos por S1 (2-43) usando visualización de picos y citometría de flujo. Todas las medidas en (EH) son un promedio de tres réplicas biológicas. Barras de error: SD

Revelando interacciones anticuerpo-pico

En pocas palabras, este estudio ha demostrado cómo la visualización de picos puede acelerar la caracterización de importantes interacciones entre anticuerpos y picos, pero también las consiguientes consecuencias de mutaciones de picos no sinónimos. Lo que también es importante es el hecho de que todo el proceso (es decir, desde el ensamblaje de Golden Gate hasta la caracterización basada en el flujo) se puede completar en menos de cinco días.

“Los estudios biofísicos posteriores pueden utilizar los picos escindidos por células sin una laboriosa purificación de proteínas recombinantes”, dicen los autores del estudio. “Una plataforma de visualización de picos de segunda generación aumentará el rendimiento mediante la integración de variantes de picos en un locus cromosómico y la clasificación de bibliotecas agrupadas para diferencias fenotípicas”, añaden.

Por lo tanto, el aumento del rendimiento permitirá la evaluación de todas las mutaciones de pico no sinónimas circulantes y la ingeniería de proteínas rápida necesaria para la estabilización previa a la fusión. Al complementar este enfoque con un escaneo mutacional profundo, podemos revelar epítopos de pan-coronavirus que no cambian y que pueden usarse para desarrollar antígenos de vacunas universales.

*Noticia importante

bioRxiv publica informes científicos preliminares que no son revisados ​​por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, guiar la práctica clínica / comportamiento relacionado con la salud o tratarse como información establecida.

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