Fusogenicidad y resistencia de SARS-CoV-2 B.1.1.7 y B.1.351 en comparación con D614G


Desde que se notificó por primera vez el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) a fines de 2019, el virus ha sufrido numerosas mutaciones, con la aparición de múltiples variantes. Algunos de estos han mostrado una mayor infectividad, mientras que otros son resistentes a los anticuerpos provocados por la cepa parental o la vacuna. Estos se denominan variantes de preocupación (VOC).

Un nuevo estudio, publicado como preimpresión en el bioRxiv* servidor, describe los efectos biológicos inducidos por mutaciones en dos COV circulantes. Estas son las cepas alfa y beta, también llamadas B.1.1.7 y B.1.351, respectivamente.

Estudio: Las variantes B.1.1.7 y B.1.351 de SARS-CoV-2 muestran una fusión mejorada mediada por Spike.  Haber de imagen: Design_Cells / Shutterstock

Fondo

La variación entre estas cepas y la cepa parental se debe principalmente a la proteína de pico, que media tanto en la unión viral al receptor de la célula huésped, la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2), como luego se somete a una escisión proteolítica en la interfaz S1 / S2. Esto da como resultado que sea cebado por la enzima huésped. TMPRSS2 y otras proteasas de la célula huésped para mediar en la fusión virus-célula así como en la fusión célula-célula (formación de sincitios).

Esto da como resultado la entrada del virus en la célula para establecer la replicación viral y la infección productiva. Por tanto, las mutaciones de pico afectan múltiples procesos, incluida la afinidad de unión a ACE2, la escisión proteolítica y la incorporación del pico en nuevas partículas virales y el ajuste de los sitios de reconocimiento de anticuerpos.

La respuesta de la célula huésped al virus implica la liberación de interferón (IFN), que es importante para impedir la entrada y la replicación viral, así como la formación de sincitios a través de proteínas transmembrana inducidas por interferón (IFITM) 1, 2 y 3. Todos estos son, en términos generales antiviral en su actividad, probablemente mejorando la rigidez de la membrana y previniendo la fusión crucial virus-célula.

Por tanto, estas proteínas restringen la infección por varios virus envueltos, incluido éste. Esta respuesta al IFN es, por tanto, una parte clave de la inmunidad innata contra los virus, lo que limita la infección y, por tanto, su deterioro está vinculado a una infección más grave.

Replicación comparable, aumento de la fusogenicidad

Los investigadores encontraron que, en comparación con la cepa de referencia D614G, las cepas alfa y beta mostraban tasas equivalentes de replicación y liberación de viriones en varias líneas celulares. Todos fueron igualmente inhibidos por IFN-β1.

En un cultivo celular de células epiteliales de las vías respiratorias humanas, los VOC alfa / beta produjeron ARN viral algo más alto, mientras que los resultados finales fueron similares en términos de niveles de viriones infecciosos.

Las cepas alfa / beta condujeron a la formación de sincitios considerablemente más altos, de 4,5 y 3 veces, respectivamente, cuando se inocularon dosis idénticas del virus en las células. Los sincitios se inhibieron igualmente para ambas variantes cuando se pretrataron con IFN-β1.

Curiosamente, cuando el D614G, alpha- y beta-proteínas de pico se expresaron en células en cultivo, las dos últimas mostraron una duplicación de la formación de sincitios, mientras que la cepa parental de Wuhan fue un poco menos fusogénica, en relación con la variante D614G.

Los hallazgos indican un mayor grado de fusión de células dentro del mismo período cuando se exponen a la misma dosis de las variantes alfa o beta en relación con la variante D614G. La formación de sincitio más rápida ocurrió con la variante alfa, seguida de la beta, en relación con la variante D614G, mientras que la introducción de este último pico aumentó la fusiogenicidad de la cepa de Wuhan.

Esto revela el papel clave que juega el sitio de escisión S1 / S2 en la formación de sincitios. Sin embargo, ninguna variante adquirió resistencia a los IFITM, lo que continuó reduciendo la fusogenicidad.

Diferentes mutaciones, diferentes efectos.

Entre las mutaciones individuales en cada uno de estos VOC, la deleción Δ69 / 70 en el RBD de la variante alfa afectó la generación de sincitios, pero a esto se opusieron las mutaciones puntuales P681H y D1118H, especialmente la primera, que causó una fusogenicidad 2,5 veces mayor en comparación con el pico D614G.

Para la cepa beta, la deleción Δ242-244 y las mutaciones puntuales de RBD, las mutaciones K417N y E484K condujeron a una formación reducida de sincitio, mientras que la mutación D251G del dominio N-terminal (NTD) tuvo un pequeño efecto correctivo. La mutación E484K también redujo la fusiogenicidad de la variante alfa.

La infección por la variante del SARS-CoV-2 aumenta la formación de sincitios en las células divididas con U2OS-ACE2 y Vero GFP.  (A) Se infectaron células U2OS-ACE2 o Vero que expresaban GFP 1-10 o GFP 11 (proporción 1: 1) 24 h después de la siembra en placas y se obtuvieron imágenes 20 h (U2OS-ACE2) o 48 h (Vero) después de la infección.  (B) Panel izquierdo: la fusión se cuantificó por área de GFP / número de núcleos y se normalizó a D614G para U2OS-ACE2 20 h después de la infección a MOI 0,001.  Panel derecho: imágenes representativas de U2OS-ACE2 20 h después de la infección, GFP-Split (verde) y Hoechst (azul).  Arriba y abajo son las mismas imágenes con y sin canal Hoechst.  (C) Panel izquierdo: fusión cuantificada de células Vero infectadas a MOI 0.01.  Panel derecho: imágenes representativas de células Vero 48 h después de la infección, GFP-Split (verde) y Hoechst (azul).  Barras de escala: 200 µm.  Los datos son la media ± DE de 8 experimentos independientes.  Análisis estadístico: ANOVA de una vía en comparación con la referencia D614G, ns: no significativo, * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001.

La infección por la variante del SARS-CoV-2 aumenta la formación de sincitios en las células divididas con U2OS-ACE2 y Vero GFP. (A) Se infectaron células U2OS-ACE2 o Vero que expresaban GFP 1-10 o GFP 11 (proporción 1: 1) 24 h después de la siembra en placas y se obtuvieron imágenes 20 h (U2OS-ACE2) o 48 h (Vero) después de la infección. (B) Panel izquierdo: la fusión se cuantificó por área de GFP / número de núcleos y se normalizó a D614G para U2OS-ACE2 20 h después de la infección a MOI 0,001. Panel derecho: imágenes representativas de U2OS-ACE2 20 h después de la infección, GFP-Split (verde) y Hoechst (azul). Arriba y abajo son las mismas imágenes con y sin canal Hoechst. (C) Panel izquierdo: fusión cuantificada de células Vero infectadas a MOI 0.01. Panel derecho: imágenes representativas de células Vero 48 h después de la infección, GFP-Split (verde) y Hoechst (azul). Barras de escala: 200 µm. Los datos son la media ± DE de 8 experimentos independientes. Análisis estadístico: ANOVA de una vía en comparación con la referencia D614G, ns: no significativo, * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001, **** P <0,0001.

¿Qué efecto tienen estas mutaciones sobre la unión de ACE2?

La afinidad de unión por el receptor ACE2 fue mayor con la variante de pico alfa, con la variante beta en segundo lugar. Las variantes D614G y Wuhan tuvieron sucesivamente menor afinidad.

La alta afinidad encontrada con las variantes alfa y beta está relacionada principalmente con la mutación RBD N501Y encontrada en ambas. El K417N que se encuentra solo en este último reduce la afinidad de ACE2. La mutación E484K tiene un efecto positivo muy pequeño sobre la unión al receptor, y el mutante NTD Δ242-244 un efecto negativo menor.

Las variantes de picos también cambiaron el ajuste de los epítopos o sitios de unión de anticuerpos. Por tanto, un anticuerpo monoclonal (MAb) dirigido al RBD de la proteína de la espiga no se unió al mutante K417N. Un segundo anticuerpo RBD mostró un fallo de reconocimiento más difuso, lo que sugiere que toda la estructura de la espiga había cambiado.

Otro MAb dirigido a la NTD no reconoció los VOC alfa o beta, y específicamente no pudo unirse a sus mutaciones NTD ΔY144 y Δ242-244.

¿Cuáles son las implicaciones?

Los investigadores demostraron que las variantes alfa y beta muestran las mismas tasas de replicación que D614G mientras son más fusogénicas, produciendo más sincitios en el mismo período con la misma dosis viral. También fueron fusogénicos más rápidamente, y ambos efectos se relacionaron con sus mutaciones de pico.

Sin embargo, la inmunidad innata permaneció activa contra ambas variantes, específicamente IFN-β1, que inhibió la infección por ambas. Además, la fusogenicidad de ambos siguió siendo sensible a los IFITM, lo que contradice los informes recientes de que la cepa alfa era más resistente a la inmunidad innata mediada por IFN.

La alta fusogénesis de la variante alfa se debe a las numerosas mutaciones con efecto fusogénico en comparación con la deleción única que reduce la formación de sincitios, en contraste directo con las mutaciones mayoritariamente restrictivas de la variante beta. Los investigadores también identificaron P681H (como el P681R que se encuentra en las variantes B.1.617.2 y B.1.617.3) como la mutación más fusogénica, que actúa en la interfaz S1 / S2 para escindir la proteína de pico y promover la fusión entre las células. .

Las mutaciones que mejoraron drásticamente la unión pico-receptor no siempre se asociaron con fusiogenicidad. Por ejemplo, con N501Y y D614G, se observó que el aumento de la fusión célula-célula aumentaba solo con el último.

Finalmente, los mutantes de pico que reducen la fusogenicidad, o al menos la dejan sin cambios, escapan con éxito al reconocimiento de anticuerpos. El mutante N501Y de alta afinidad, por otro lado, deja al virus susceptible a anticuerpos neutralizantes. Las mutaciones RBD E484K y K417N producen aumentos mucho menores en la afinidad de unión por ACE2.

Esto indica que se ha producido algún grado de compensación, lo que permite al virus evadir la neutralización mediada por anticuerpos aunque su eficacia final se vea afectada por ello. La propagación exitosa de estas cepas puede indicar la capacidad de la combinación de mutaciones para evadir el reconocimiento mediante anticuerpos neutralizantes.

Sin embargo, no todos los anticuerpos neutralizantes restringen la formación de sincitios; algunos solo inhiben la fusión virus-célula. Esto puede deberse a que el primero es más resistente a los anticuerpos que el virus fuera de la célula.

El aumento a la dominancia de la cepa alfa B.1.1.7 puede deberse a las características que se muestran aquí, como una alta afinidad por el receptor ACE2 y una mayor fusogenicidad, por lo que ha superado a la variante beta a nivel mundial. Se requieren más estudios para comprender si estas son las únicas razones y el papel que juegan las mutaciones en estas características biológicas en variantes más nuevas que ahora se están extendiendo rápidamente por todo el mundo.

*Noticia importante

bioRxiv publica informes científicos preliminares que no son revisados ​​por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, guiar la práctica clínica / comportamiento relacionado con la salud o tratarse como información establecida.

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