Identificación de dianas susceptibles de ser farmacológicas en una proteína esencial del SARS-CoV-2


La maquinaria para la replicación y transcripción viral se traduce de secciones particulares del genoma del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2), marcos de lectura abiertos 1a y 1b (ORF1a y ORF1b). Se producen dieciséis proteínas no estructurales (NSP) tras la traducción. De estos, algunos parecen estar altamente conservados en los linajes de coronavirus debido al papel vital y esencial que desempeñan estas proteínas en la replicación, lo que hace que la aparición de mutantes distintos y exitosos sea poco común. En un artículo de investigación subido recientemente al servidor de preimpresión bioRxiv* por Newman et al. (15 de marzoth, 2021) se investiga la estructura y el papel de una de esas proteínas: NSP13, y se identifican dos dianas atractivamente farmacológicas, lo que posiblemente abre una nueva ruta hacia un nuevo agente antivírico del SARS-CoV-2.

¿Qué es NSP13?

NSP13 es una proteína helicasa de 67 kDa, siendo las helicasas una clase de enzimas que separan ácido nucleico hebras y, por lo tanto, están directamente involucradas en muchos procesos celulares como la replicación, la transcripción y la traducción. NSP13 pertenece a la superfamilia de helicasa 1B, esta clasificación adicional indica que la proteína no forma una estructura de anillo, como es el caso de todas las helicasas de ARN conocidas en eucariotas, aunque se han encontrado algunas helicasas formadoras de anillo en virus, y que la enzima realiza la translocación en la dirección 5′-3 ‘.

Estructura general de SARS-CoV-2 NSP13.  (A) Descripción general de la estructura con dominios etiquetados y coloreados individualmente (se usa el mismo esquema de color en todas partes).  El nucleótido AMP-PNP se muestra en formato de barra en el sitio de unión del nucleótido entre los dominios 1A y 2A.  (B) Vista de cerca del modo de unión de nucleótidos para el complejo AMP-PNP Mg2 + (modo A), con los residuos que interactúan etiquetados y mostrados en el formato de barra.  (C) Vista cercana de la unión de nucleótidos del complejo AMP-PNP (modo B), visto desde la misma orientación que el panel B.

Estructura general de SARS-CoV-2 NSP13. (A) Descripción general de la estructura con dominios etiquetados y coloreados individualmente (se usa el mismo esquema de color en todas partes). El nucleótido AMP-PNP se muestra en formato de barra en el sitio de unión del nucleótido entre los dominios 1A y 2A. (B) Vista de cerca del modo de unión de nucleótidos para el complejo AMP-PNP Mg2 + (modo A), con los residuos que interactúan etiquetados y mostrados en el formato de barra. (C) Vista cercana de la unión de nucleótidos del complejo AMP-PNP (modo B), visto desde la misma orientación que el panel B.

NSP13 contiene 5 dominios: un dominio de unión a zinc N-terminal, un tallo helicoidal, un barril beta y dos dominios de unión que hacen contacto con los nucleótidos. La proteína también es estructuralmente muy similar tanto en MERS-CoV como en SARS-CoV-1, diferenciándose en un solo aminoácido en el caso de este último, por lo que se ha propuesto como un objetivo prometedor para los fármacos antivirales. Ya se ha llevado a cabo algún desarrollo farmacológico preliminar para drogar esta proteína diana en particular, dada su presencia fuertemente conservada incluso en virus aún más distantes. Sin embargo, la estructura precisa de esta proteína aún no se ha aclarado por completo para el SARS-CoV-2. Las estructuras cristalográficas de rayos X son el estándar de oro para determinar la conformación de proteínas en varios en el lugar modos, teniendo en cuenta cuando se une a los nucleótidos diana y cuando forma parte del supercúmulo de transcripción de proteínas. El grupo descubrió dos posibles bolsas de unión de esta manera, y además realizó un cribado de fragmentos de la proteína para probar la capacidad de ligadura, proporcionando una estructura de partida en la que se puede basar el diseño racional de los fármacos.

La estructura cristalina de NSP13

Se examinaron tres conformaciones de las proteínas: la forma APO, cuando está libre y no unida a las proteínas cofactor enzimáticas asociadas; la forma unida a fosfato, que es activa; y la forma unida a nucleótidos, representativa de cuando participan en actividad enzimática. En cada caso, se observó que las cadenas eran similares a las descritas anteriormente para NSP13 en organismos relacionados. Sin embargo, aunque las cadenas tenían una secuencia similar, se encontró que la estructura conformacional general difería en algunas regiones hasta en 3 Å, atribuido al dominio de unión a zinc flexible y a los dominios de unión a nucleótidos.

Modelo para el mecanismo de translocación NSP13 de 5 'a 3'.  (A) Mecanismo de translocación propuesto para NSP13 basado en la transición de la forma cerrada (prehidrólisis) a la forma abierta (Producto y APO).  Las transiciones se inician por la unión, hidrólisis y liberación de ATP que desencadena los cambios conformacionales y remodela la interfaz del ARN.  (B) Vista de cerca del sitio activo con ATP en la conformación cerrada (izquierda) y ADP y Pi en la conformación abierta (derecha).  La hidrólisis como repulsión de carga posterior podría desencadenar la apertura de la hendidura entre los dos dominios con motivos conservados en el dominio 2A que contactan principalmente con el producto fosfato mientras que el producto ADP interactúa con el dominio 1A.  Varios de los motivos que interactúan con el fosfato están próximos a las regiones de la interfaz de unión del ARN, lo que indica la posibilidad de modulación en función del estado de hidrólisis.  (C) Remodelación de la interfaz de ARN en base a la posición adoptada por el dominio 1B.  La conformación cerrada se muestra a la izquierda y la abierta a la derecha.  Se muestran las áreas de contacto para las regiones de ARN 5 'y 3' (representadas en gris y negro).

Modelo para el mecanismo de translocación NSP13 de 5 ‘a 3’. (A) Mecanismo de translocación propuesto para NSP13 basado en la transición de la forma cerrada (prehidrólisis) a la forma abierta (Producto y APO). Las transiciones se inician por la unión, hidrólisis y liberación de ATP que desencadena los cambios conformacionales y remodela la interfaz del ARN. (B) Vista de cerca del sitio activo con ATP en la conformación cerrada (izquierda) y ADP y Pi en la conformación abierta (derecha). La hidrólisis como repulsión de carga posterior podría desencadenar la apertura de la hendidura entre los dos dominios con motivos conservados en el dominio 2A que contactan principalmente con el producto fosfato mientras que el producto ADP interactúa con el dominio 1A. Varios de los motivos que interactúan con el fosfato están próximos a las regiones de la interfaz de unión del ARN, lo que indica la posibilidad de modulación en función del estado de hidrólisis. (C) Remodelación de la interfaz de ARN en base a la posición adoptada por el dominio 1B. La conformación cerrada se muestra a la izquierda y la abierta a la derecha. Se muestran las áreas de contacto para las regiones de ARN 5 ‘y 3’ (representadas en gris y negro).

Se pudieron observar cambios específicos en los sitios de unión de nucleótidos a medida que la proteína pasaba entre estados abiertos y cerrados, a los cuales el grupo atribuye el mecanismo de translocación de la proteína a lo largo de la cadena de nucleótidos. Cuando está en la conformación cerrada, el ARN se une a la proteína preferentemente a través de uno de los dos dominios de unión, con el enlace más débil hacia el extremo 3 ‘. La hidrólisis de ATP desencadena el cambio conformacional al estado abierto, invirtiendo las afinidades y desplazando la proteína a lo largo de la cadena en un nucleótido.

Cribado de fragmentos cristalográficos

La forma unida a fosfato de NSP13 se cristalizó y 648 cristales se empaparon individualmente en una biblioteca de fragmentos químicos. A continuación, se realizó un análisis de rayos X y se identificaron los ligandos unidos. Se identificaron 65 fragmentos para unirse a varios sitios de la proteína, 15 de los cuales se superpusieron al resto de ATP ribosa. Varios otros se ubicaron cerca del bolsillo de unión de ARN / ADN y se esperaría que bloquearan la interacción con la proteína. Se esperaba que un pequeño número de ligandos adicionales se unieran al dominio de zinc de la proteína con el dominio del tallo, lo que impedía los cambios conformacionales necesarios para participar en la unión de nucleótidos.

Se realizó un análisis computacional adicional de los sitios objetivo, en particular, notando que el bolsillo de unión del ARN 5 ‘es eminentemente farmacológico debido al ambiente hidrofóbico, buena accesibilidad cuando la proteína está en la conformación abierta y alta conservación en otros coronavirus.

Fragmentos unidos a las interfaces entre dominios que parecen moverse como parte del ciclo catalítico y, por tanto, pueden ser puntos de partida para el diseño de inhibidores alostéricos.  (A) Vista de la superficie de un sitio de unión de fragmentos prominente que se unió a 11 fragmentos en una hendidura entre los dominios de zinc y tallo con los dominios coloreados individualmente como para el esquema de color en la Fig1.  (B) Se observó que dos fragmentos se unían en una hendidura entre los dominios 1A y 2A aproximadamente opuestos a la bisagra.  (C) Tres fragmentos se unieron en un bolsillo poco profundo entre el tallo y el dominio 1B (también cerca de la interfaz de ARN) y hacen contactos polares en ambas regiones.

Fragmentos unidos a las interfaces entre dominios que parecen moverse como parte del ciclo catalítico y, por tanto, pueden ser puntos de partida para el diseño de inhibidores alostéricos. (A) Vista de la superficie de un sitio de unión de fragmentos prominente que se unió a 11 fragmentos en una hendidura entre los dominios de zinc y tallo con los dominios coloreados individualmente como para el esquema de color en la Fig1. (B) Se observó que dos fragmentos se unían en una hendidura entre los dominios 1A y 2A aproximadamente opuestos a la bisagra. (C) Tres fragmentos se unieron en un bolsillo poco profundo entre el tallo y el dominio 1B (también cerca de la interfaz de ARN) y hacen contactos polares en ambas regiones.

*Noticia importante

bioRxiv publica informes científicos preliminares que no son revisados ​​por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, guiar la práctica clínica / comportamiento relacionado con la salud o tratarse como información establecida.

Referencia de la revista:

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