Investigadores del MIT desarrollan un ensayo molecular para detectar niveles subpicomolares del dominio de unión al receptor del SARS-CoV-2


Un equipo de investigadores del MIT ha desarrollado un ensayo molecular para detectar niveles subpicomolares del SARS-CoV-2. proteína de pico dominio de unión al receptor (S-RBD) utilizando balizas peptídicas validadas computacionalmente en una detección de un solo paso a través de la producción de una señal de fluorescencia. El equipo ha publicado sus hallazgos sobre el bioRxiv* servidor de preimpresión.

Las pruebas de diagnóstico más empleadas para el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2), los agentes causantes de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), son las basadas en la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR). métodos – con límites de detección (LoD) de 102-103 copias de ARN / ml, que es aproximadamente 1-10 ARN attomolar (aM) en el volumen de prueba.

Estudio: Detección subpicomolar de SARS-CoV-2 RBD a través de balizas peptídicas optimizadas computacionalmente.  Haber de imagen: Design_Cells / Shutterstock

Sin embargo, las pruebas de RT-PCR son laboriosas y requieren costosas ácido nucleico pasos de aislamiento, purificación y procesamiento. Esto aumenta tanto el tiempo de respuesta de la detección como el costo de las pruebas. Si bien existen otras tecnologías basadas en CRISPR y amplificación mediada por bucle para el diagnóstico, los diagnósticos rápidos en el punto de atención para detectar el SARS-CoV-2 pueden acelerar la lucha para controlar los brotes de la infección.

En un estudio reciente, investigadores del Instituto de Tecnología de Massachusetts (MIT) diseñaron balizas moleculares, utilizando un diseño de proteínas de aprendizaje profundo, que se iluminan a concentraciones subpicomolares altamente sensibles del SARS-CoV-2 RBD (dominio de unión al receptor). ). La baliza funciona como un interruptor conformacional: se enciende en presencia del RBD viral al producir una señal de fluorescencia utilizando un par fluoróforo-extintor.

Las balizas forman un heterodímero que contiene dos péptidos juntos, con un ligando de unión entre ellos para detectar la presencia de S-RBD.

En ausencia de S-RBD (OFF), las balizas peptídicas adoptan una conformación cerrada que se abre cuando se une al S-RBD, y el par fluoróforo-extintor en los dos extremos de los tallos heterodímeros produce una señal de fluorescencia (ON).

Los investigadores demostraron que dos balizas candidatas, C17LC21 y C21LC21, pueden detectar el RBD con límites de detección (LoD) en el rango subpicomolar.

Nuestro objetivo final es integrar estas balizas optimizadas dentro de microscopios miniaturizados de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF), que proporcionan una sensibilidad exquisita al excitar los fluoróforos presentes dentro de la proximidad nanométrica de la superficie del dispositivo, produciendo altas relaciones de señal a fondo y permitiendo una rápida y ultra- detección sensible de SARS-CoV-2 ”, dijeron los investigadores.

Aquí, los investigadores han utilizado el mecanismo de transferencia de energía de resonancia de Forster (FRET), donde la eficiencia de la transferencia de energía entre el fluoróforo y el extintor es proporcional a su distancia espacial. La presencia o ausencia del S-RBD provoca un pequeño cambio en la distancia espacial entre los dos brazos de la baliza, cambiando drásticamente la eficiencia del FRET.

Por tanto, esto afecta el rendimiento cuántico fluorescente del fluoróforo. El aumento de la señal de fluorescencia es proporcional a la cantidad de S-RBD presente. Los investigadores han utilizado el par fluoróforo-extintor de uso común: isotiocianato de fluoresceína (FITC) y [4-(N,N-dimethylamino)phenylazo] benzoilo (DABCYL), respectivamente.

Los investigadores seleccionaron computacionalmente los candidatos a baliza peptídica (C13LC21, C17LC21 y C21L21) que acoplaron con éxito el S-RBD separando los dos brazos de baliza que albergan el fluoróforo y el extintor, cambiando a la conformación ON.

Después de esta confirmación, probaron experimentalmente estos tres diseños de balizas peptídicas para determinar la capacidad de unión con S-RBD en células humanas y la respuesta de detección. in vitro. Observaron que el C17LC21 mostró la mayor sensibilidad hacia S-RBD con un LoD de casi 20 fM (Kd = 1.615 × 10−12), seguido de C21LC21 que tiene un LoD de 400 fM (Kd = 6,766 × 10−13).

Concluyeron que C17LC21 y C21LC21 podrían detectar la presencia de S-RBD con sensibilidad subpicomolar y baja reactividad cruzada. Motivando así la aplicación de estas balizas moleculares para la detección rápida de SARS-CoV-2.

Este trabajo “muestra un caso de uso de las herramientas actuales de aprendizaje profundo para la predicción de la estructura de proteínas en una tubería de diseño de proteínas”, dijeron los investigadores. Lo demostraron empleando un enfoque híbrido de herramientas de modelado de proteínas de última generación para el diseño de balizas moleculares. Seguido de una sólida validación experimental, este diseño de baliza molecular sirve como una plataforma poderosa para combatir COVID-19 y futuras amenazas virales emergentes.

Los investigadores escriben:

En este estudio, utilizando las herramientas de aprendizaje profundo existentes para la predicción de la estructura de proteínas y los conjuntos de modelos basados ​​en energía, diseñamos y probamos un conjunto de balizas moleculares que pueden unirse de manera potente al S-RBD y liberar una señal de fluorescencia a través de FRET, lo que permite sub-picomolar niveles de detección “.

La integración de estas balizas de péptidos dentro de sensores ópticos, como los microscopios TIRF en miniatura, puede reducir el LoD a un nivel subfemtomolar, produciendo así una plataforma de diagnóstico rápido en el punto de atención para el SARS-CoV-2, prevén los investigadores.

*Noticia importante

bioRxiv publica informes científicos preliminares que no son revisados ​​por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, guiar la práctica clínica / comportamiento relacionado con la salud o tratarse como información establecida.

.



Source link