La tecnología Nanopore permite la secuenciación genómica del SARS-CoV-2 en el punto de atención


A medida que el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) continúa propagándose en todo el mundo y causa enfermedad y muerte a una escala devastadora, la secuenciación genómica se ha convertido en un método principal para realizar un seguimiento de las variantes emergentes y los nuevos brotes. Un nuevo medRxiv* preprint explora el papel de la secuenciación de nanoporos en este esfuerzo.

Estudio: https://www.news-medical.net/news/20210714/Nanopore-technology-allows-point-of-care-SARS-CoV-2-genomic-sequencing.aspx.  Haber de imagen: vchal / Shutterstock

Fondo

La tecnología de secuenciación Nanopore permite una secuenciación profunda, siendo móvil, asequible y escalable. Además, no requiere una gran inversión en dispositivos o redes de tecnología de la información. Además, se puede utilizar para secuenciar cualquier tipo de material genético, ya sea ácido ribonucleico o ácido desoxirribonucleico (ARN o ADN, respectivamente).

Por lo tanto, se presta a redes de secuenciación establecidas a nivel mundial. Esto podría permitir que las variantes de preocupación (COV) se identifiquen temprano y se rastreen con mayor precisión, utilizando las instalaciones disponibles en pequeños laboratorios en el punto de atención.

Estas variantes son problemáticas precisamente porque se propagan más rápido, son más infecciosas o escapan a la respuesta inmune, y por alguna o todas estas razones, es menos probable que estén contenidas por las mismas estrategias que están vigentes. Su identificación temprana es, por tanto, una cuestión urgente.

Incluso aparte de esto, la búsqueda del origen del virus es continua, y los datos genómicos también serán de gran utilidad en esta búsqueda.

¿Cómo se realizó el estudio?

La secuenciación de nanoporos fue, por lo tanto, el foco del estudio actual, cuyo objetivo es ponerlo en práctica con sistemas de diagnóstico que se utilizan de forma rutinaria. Habiéndolo modificado para mayor velocidad y simplicidad, los investigadores lo probaron en muestras que contenían SARS-CoV-2 recolectadas de forma rutinaria. También identificaron factores que operan antes del análisis para influir en el éxito de la secuenciación.

Purificación de ARN y PCR

Los investigadores utilizaron un protocolo de purificación de ARN basado en perlas magnéticas a partir de muestras de diagnóstico residuales. Descubrieron que este protocolo, que utilizaba muestras directas de muestras residuales, no solo era eficiente en términos de muestreo, sino que permitía omitir algunos pasos, lo que simplificaba el flujo de trabajo.

También determinaron que podría usarse RT-PCR semicuantitativa o cuantitativa, con los grupos de cebadores multiplex 1 y 2, para realizar la transcripción inversa del ARN del SARS-CoV-2 (+) así como para amplificar amplicones de 1200 pb.

El conjunto de cebadores divididos de medianoche del protocolo ARTIC se utilizó por primera vez en dos ciclos de PCR multiplex para amplificar el ADNc del SARS-CoV-2. Aquí, cada reacción de PCR da lugar a amplicones de 1200 pb que están en orden consecutivo, lo que proporciona un conjunto de secuencias en mosaico que no se superponen. Las dos mezclas de amplicones complementarios se combinan luego para permitir la secuenciación del genoma completo del SARS-CoV-2.

Esto mostró que la intensidad de la banda dependía en gran medida de las cargas virales, pero también variaba con los umbrales del ciclo entre los dos grupos. Este enfoque, llamado el enfoque del “cebador de medianoche”, tuvo éxito en el proceso de preparación del proceso de transcripción inversa.

Preparación y secuenciación de bibliotecas

Usando el kit de código de barras rápido (SQK-RBK004, Oxford Nanopore) para la preparación de la biblioteca, los investigadores descubrieron que podían secuenciar los productos de PCR de inmediato, sin purificación previa. Usando dos dispositivos separados, encontraron que se podía lograr una profundidad de lectura adecuada de aproximadamente 10 Mbp por código de barras en diferentes puntos de tiempo, según el la carga viral.

Además, secuenciaron todo el genoma en un dispositivo MinION Mk1C (Oxford Nanopore) utilizando los grupos multiplexados 1 y 2, logrando una cobertura profunda completa (es decir, al menos 10 megabases para cada código de barras). Por tanto, todos los amplicones de 1200 pb se amplificaron de forma eficaz y específica mediante esta reacción de PCR multiplexada.

Fusionar secuencias de consenso

Utilizaron un proceso de fusión para resolver regiones sin resolver en dos secuencias devueltas por dos algoritmos diferentes. Esta secuencia de ‘superconsenso’ no solo tenía muchas menos regiones sin resolver, sino que mostraba mutaciones de alta calidad, al tiempo que eliminaba los falsos positivos en su mayor parte.

Por lo tanto, el programa de fusión de consenso es útil para lograr llamadas de alta calidad entre variantes, pero enfatiza que las secuencias derivadas de los dos algoritmos diferentes utilizados aquí son complementarias en la secuenciación de nanoporos. La desventaja es la pérdida de información sobre el número de lecturas por variante y esos metadatos.

Se logró una única secuencia completa de alta calidad con un título de SARS-CoV-2 de 4 x 106 o mas alto. Esto apoya la teoría de que un número de copias por debajo de 4 x 106 indica genomas incompletos. En otras palabras, “proporcionamos aquí una línea convincente de evidencia de que los valores de CT normalizados por el número de copias de RT-qPCR de diagnóstico se pueden utilizar como criterio de éxito de la secuenciación. “

Por encima de este umbral, los especímenes podrían asignarse correctamente a diferentes clados.

¿Cuáles son las implicaciones?

Por lo tanto, los investigadores pudieron pulir su tubería de laboratorio, de modo que el ARN purificado se pueda usar directamente a partir de muestras residuales, utilizando valores de umbral de ciclo como el criterio principal para la selección de muestras; Se llevaron a cabo reacciones tanto de ADNc como de PCR multiplex repetidas utilizando grupos de cebadores divididos de medianoche. El uso del dispositivo Oxford Nanopore MinION Mk1C aseguró la llamada de base de Guppy a bordo, lo que redujo tanto el tiempo consumido como el número de pasos.

Por lo tanto, este protocolo es adecuado para su implementación en laboratorios más pequeños adjuntos a los hospitales, de manera rentable, lo que permite la simplificación y descentralización del proceso de secuenciación. “Después del diagnóstico de qRT-PCR, la preparación de la biblioteca multiplex, los controles de calidad, la secuenciación de nanoporos y el proceso bioinformático se pueden realizar por completo en un día hábil. “

*Noticia importante

medRxiv publica informes científicos preliminares que no son revisados ​​por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, guiar la práctica clínica / comportamiento relacionado con la salud o tratarse como información establecida.

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