Las supresiones del pico del SARS-CoV-2 con escisión de furina se suprimen en su mayoría dentro del epitelio de las vías respiratorias infectadas


La pandemia de la enfermedad del coronavirus 2019 (COVID-19) ha causado una gran devastación en la vida y el bienestar humanos. Es poco probable que las dificultades actuales terminen a menos que se logre la inmunidad de la población. El agente causante de COVID-19, el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus-2 (SARS-CoV-2), se ha extendido a todas las regiones del mundo, con más de 106 millones de infecciones documentadas y más de 2,3 millones de víctimas hasta ahora.

Un equipo de investigadores examinó recientemente el transcriptoma del SARS-CoV-2 y la dinámica del sitio de división de furina del gen S en el epitelio primario de las vías respiratorias humanas. El equipo ha publicado sus hallazgos sobre el bioRxiv* servidor de preimpresión.

Estudio: El transcriptoma del SARS-CoV-2 y la dinámica del sitio de división de furina del gen S en el epitelio primario de las vías respiratorias humanas.  Haber de imagen: Design_Cells / Shutterstock

Pico de SARS-CoV-2

Este virus tiene un genoma grande de 30 kb, que codifica sus proteínas estructurales y no estructurales, así como varias proteínas accesorias. los proteínas de pico de los varios coronavirus comparten 77% de homología.

La proteína pico del SARS-CoV-2 tiene dos subunidades, la S1 y la S2. S1 media la unión del receptor de la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) de la célula huésped-espiga viral, mientras que S2 media la entrada viral en la célula huésped a través de la fusión de la membrana.

La proteína de pico es el antígeno inmunodominante en la infección humana, además de desempeñar un papel central en el tipo de célula huésped a la que se dirige el virus, la patogenicidad del virus y su transmisibilidad. En la naturaleza, se presenta como un homotrímero en la superficie de la partícula viral.

Es importante destacar que el pico de SARS-CoV-2 es diferente del de los coronavirus similares al SARS de murciélago estrechamente relacionados que codifican un sitio de escisión de furina polibásico único (FCS) en la interfaz S1 / S2. Este se compone de cuatro aminoácidos, PRRA.

El propio gen FCS está compuesto por la secuencia RRAR ↓ S. Su presencia en este virus, pero no en otros betacoronavirus, indica que es crucial para la virulencia del virus al aumentar el rango de hospedadores, el rango de tropismo celular, su transmisibilidad y patogenicidad.

Rápida aparición de deleciones de FCS

Cuando se cultivó en células Vero, derivadas de células de mono verde africano, el SARS-CoV-2 produjo rápidamente mutaciones interfaciales S1 / S2 que incluyeron la pérdida del FCS con los aminoácidos proximales y distales en sus viriones descendientes. Estos formaron una población dominante estable con repetidos pases.

El gen de pico es el más variable entre todos los genes del SARS-CoV-2, y la región FCS en la interfaz S1 / S2 es especialmente propensa a mutaciones. Se han identificado una variedad de deleciones y mutaciones en esta región en células Vero infectadas con el virus.

Especialmente, un mutante que comprende una deleción de 30 pares de bases fue capaz de replicarse más eficientemente dentro de las células Vero, convirtiéndose en la cepa dominante al pasar. También se encontró otra deleción de 21 pares de bases después de dos o tres pases. Sin embargo, estos no se han encontrado en el aislado clínico que se pasó originalmente. Esto muestra que estos se adquirieron durante los pases de células Vero.

Los aislados clínicos muestran la presencia de muchas deleciones alrededor del FCS. El estudio actual tuvo como objetivo comprender cómo surgieron durante el crecimiento del virus en las vías respiratorias humanas.

Detalles del estudio

Los investigadores utilizaron métodos de secuenciación de ARN para explorar la transcripción del virus en células del epitelio de las vías respiratorias humanas (AEH) infectadas, cultivadas para simular la infección natural de las vías respiratorias humanas. Esto se logró cultivándolos en una interfaz aire-líquido (HAE-ALI).

Este método de cultivo produjo un patrón transcriptómico que se parecía más al del epitelio de las vías respiratorias humanas ordinarias en pacientes con COVID-19. En ambos cultivos de células HAE-ALI y Vero infectadas con SARS-CoV-2, las transcripciones de la nucleocápside (N), en forma de ARN subgenómico (sgRNA), eran abundantes, con niveles más bajos de transcripciones de espigas (S).

Encontraron que las diferencias significativas involucraban principalmente las deleciones en la interfaz S1 / S2. La alta tasa de deleciones de FCS contribuyó a un porcentaje mucho menor de sgRNA en relación con todos los sgRNA canónicos, en sólo el 50%, en células HAE-ALI infectadas.

Se encontraron dos deleciones en el FCS a niveles dramáticamente mejorados en dos culturas. Uno es una deleción de 12 aminoácidos (mut-del1), 678TNSPRRAR ↓ SVAS689, incluido el FCS. El segundo es una deleción de 5 aminoácidos (mut-del2), 675QTQTN679, inmediatamente aguas arriba del FCS.

Selección específica de donantes

Observaron que la presión de selección específica del donante operaba dentro de estas células HAE-ALI para prevenir o seleccionar tales deleciones. Esto se demostró por la presencia de mut-del2 en el 42% de las células infectadas a los 21 días después de la infección, y de mut-del1 en el 54% a los 13 días después de la infección, en dos de siete cultivos celulares diferentes basados ​​en células obtenidas de diferentes donantes.

Mut-del1 puede ser más importante clínicamente que mut-del1, ya que se encontró en tres de 68 muestras en un estudio anterior.

Por el contrario, la aparición de deleciones de FCS se suprimió en otros cinco cultivos, encontrándose menos del 1% de las deleciones el día 13 después de la infección. Por tanto, los cultivos de HAE-ALI de diferentes donantes llevaron a la selección de diferentes deleciones de FCS.

Deleciones de FCS y entrada viral

Mut-del2 no conduce a la pérdida de FCS, pero previene la escisión mediada por furina debido a la mutación corriente arriba. Como resultado, el procesamiento de picos se vio drásticamente afectado. Ambas deleciones llevaron a la imposibilidad de usar furina o TMPRSS2 para lograr la fusión del virus con la membrana plasmática, inhibiendo así la entrada del virus en la célula.

El rango de tropismo celular también se vio limitado por las deleciones de FCS. Las células que expresaron TMPRSS2 no mostraron la presencia de deleciones de FCS, lo que respalda el papel de las últimas en la abolición de la capacidad de las primeras para mediar en la fusión virus-célula.

Sin embargo, las mutaciones de FCS entre viriones recién formados se acumularon en dos cultivos celulares. Estos fueron los mismos aislados de células de las vías respiratorias que mostraron niveles amplificados de mutantes, lo que indica su permisividad a la infección por mutantes con FCS suprimido. Esto podría deberse a que, al carecer de una alta expresión de TMPRSS2, permitieron la infección por otras vías que involucraban catepsina-entrada endosomal dependiente del virus.

Además, los hallazgos de la reducción relacionada con mut-del2 en la entrada viral y la infección en las células Vero podrían indicar que el FCS es un factor de virulencia. En este caso, debería reducir la gravedad de la enfermedad pulmonar en animales. Por lo tanto, se indican estudios adicionales para comprender con qué frecuencia ocurren tales deleciones en la infección humana, cómo se transmiten tales mutantes entre humanos y el grado de patogenicidad.

Análisis de inmunofluorescencia de la infección por SARS-CoV-2 de células HAE.  Se infectaron cultivos de HAE-ALIB2-20 con SARS-CoV-2 a una MOI de 0,2 o 2 ufp / célula, como se indica, infectados de forma simulada (Mock).  A los 4 días después de la infección, se fijó un trozo de la membrana del inserto en paraformaldehído al 4% en PBS a 4ºC durante la noche.  y sometido a análisis de inmunofluorescencia directo.  Las membranas se tiñeron con proteína N (NP) anti-SARS-CoV-2.  Las imágenes se tomaron en un microscopio confocal Leica TCS SPE de 40 ×, que fue controlado por el software Leica Application Suite X.  Los núcleos se tiñeron con DAPI (4 '=, 6-diamidino-2-fenilindol).  La barra de escala es de 20 µM.

Análisis de inmunofluorescencia de la infección por SARS-CoV-2 de células HAE. Se infectaron cultivos de HAE-ALIB2-20 con SARS-CoV-2 a una MOI de 0,2 o 2 ufp / célula, como se indica, infectados de forma simulada (Mock). A los 4 días después de la infección, se fijó un trozo de la membrana del inserto en paraformaldehído al 4% en PBS a 4ºC durante la noche. y sometido a análisis de inmunofluorescencia directo. Las membranas se tiñeron con proteína N (NP) anti-SARS-CoV-2. Las imágenes se tomaron en un microscopio confocal Leica TCS SPE de 40 ×, que fue controlado por el software Leica Application Suite X. Los núcleos se tiñeron con DAPI (4 ‘=, 6-diamidino-2-fenilindol). La barra de escala es de 20 µM.

¿Cuáles son las implicaciones?

Estos resultados demuestran que el virus está sujeto a una fuerte presión selectiva dentro de las células de las vías respiratorias humanas, para mutaciones adaptativas en la proteína de pico. La vigilancia para identificar mutaciones de pico es esencial para identificar mutaciones de escape, así como aquellas que afectan o aumentan la infectividad o transmisibilidad viral, o la virulencia. El estudio actual utilizó con éxito el modelo HAE-ALI polarizado para explorar mutantes de pico en una variedad de escenarios.

Los investigadores encontraron que la fuerza de selección en las partículas virales liberadas apicalmente de las células de las vías respiratorias humanas polarizadas infectadas condujo a la retención estable del FCS y a la estabilidad general de los picos en la mayoría de los casos, excepto en dos cultivos aislados de dos individuos diferentes. En estos dos casos, persistieron altas tasas de deleción de FCS.

Nuestro estudio presenta evidencia del papel de las propiedades únicas de los epitelios de las vías respiratorias humanas en la dinámica de la región FCS durante la infección de las vías respiratorias humanas, que depende del donante “.

*Noticia importante

bioRxiv publica informes científicos preliminares que no son revisados ​​por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, guiar la práctica clínica / comportamiento relacionado con la salud o tratarse como información establecida.

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