Las variantes emergentes del SARS-CoV-2 contienen mutaciones que interfieren con la secuenciación genómica


A medida que el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) comenzó su marcha mortal en todo el mundo a fines de 2019, comenzando la pandemia de la enfermedad del coronavirus 2019 (COVID-19), la contención viral ha sido el enfoque principal junto con la tratamiento de enfermedades sintomáticas.

La vigilancia genómica ha jugado un papel protagónico en la identificación temprana de variantes emergentes de preocupación (COV) que amenazan con provocar resurgimientos de la infección en áreas con cierto grado de control. Estos COV contienen mutaciones que pueden permitir al virus escapar de la neutralización por anticuerpos de otras cepas o evadir la respuesta inmune. Otras mutaciones pueden aumentar la infectividad o la transmisibilidad viral.

Estudio: Las mutaciones en las variantes emergentes de linajes preocupantes interrumpen la secuenciación genómica de las muestras clínicas del SARS-CoV-2.  Haber de imagen: joshimerbin / Shutterstock

Este trabajo depende de la combinación de secuencias del genoma completo de todo el mundo. Un estudio reciente realizado por investigadores en Canadá muestra cómo las mutaciones en los linajes emergentes de SARS-CoV-2 pueden interrumpir el proceso de secuenciación y, por lo tanto, interferir con esta importante área de investigación. El equipo ha publicado sus hallazgos como una preimpresión en el medRxiv* servidor.

Fondo

La secuenciación genómica se basa en el uso de material genético viral amplificado, o ácido ribonucleico (ARN), de muestras clínicas. La amplificación es necesaria porque las concentraciones de ARN viral en tales muestras son muy bajas.

El proceso que se suele utilizar para la amplificación se basa en la secuenciación de amplicones, utilizando múltiples reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) ejecutadas en paralelo. Cada uno usa un conjunto diferente de cebadores, o bits de ARN, que desencadenan el proceso de síntesis de ARN.

Cada cebador debe unirse a su región complementaria en el ARN viral, más bien como los dos lados de una cremallera que se engranan. Luego desencadenan la síntesis de ARN complementario a partir de la hebra molde.

Los cebadores se utilizan en pares y escalonados en todo el genoma, con la esperanza de amplificar toda la cadena de ARN del virus. Sin embargo, las mutaciones en las cepas más nuevas pueden desestabilizar el enlace entre el cebador y el ARN molde, lo que perjudica su desempeño.

Las brechas resultantes en la cobertura del genoma reducen el número de genomas completos de SARS-CoV-2 de alta calidad.

¿Qué estimuló esta investigación?

Por ejemplo, el Laboratorio de Salud Pública del Centro de Control de Enfermedades de Columbia Británica (BCCDC PHL) encontró piezas faltantes en tres amplicones que cubrían partes del ORF viral (marco de lectura abierto) 1a y el gen del pico en su secuenciación del SARS-CoV P.1 local. -2 cepas por el esquema de amplicones Freed.

En el estudio actual, de British Columbia (BC), Canadá, los investigadores exploraron las razones, enfocándose en el desempeño de este esquema que usa amplicones de 1.200 pares de bases (bp) para secuenciar el genoma viral. Supusieron que estas lagunas se debían al fallo del cebador debido a mutaciones en la variante P.1.

Analizaron las secuencias de P.1 locales obtenidas por el BCCDC PHL antes del 7 de abril de 2021, así como las cargadas a la base de datos mundial de SARS-CoV-2 llamada GISAID (Iniciativa global para compartir todos los datos de influenza). Descubrieron que más del 98% de las secuencias mostraban tres variantes en el sitio del cebador.

Curiosamente, las variantes del cebador estaban en los mismos amplicones que no se amplificaron con el esquema del cebador Freed. Estos fueron los amplicones 21, 24 y 25.

Las variantes del cebador crean desajustes con la plantilla de ARN

En el primero, amplicón 21, se encontraron dos desajustes entre el cebador y el ARN variante, uno en el extremo 3 ‘, que es importante para la síntesis de ARN. Como resultado, este amplicón se vio más afectado en términos de profundidad de cobertura o número de lecturas.

Los otros dos amplicones contenían desajustes únicos con los cebadores, pero ambos estaban más cerca del extremo 5 ‘de la cadena de ARN. Esta observación descarta la interferencia obvia con la síntesis de ARN que se observa con el desajuste del amplicón 21, lo que significa que deben buscarse otras explicaciones, no basadas únicamente en la posición, a partir de las observaciones empíricas.

Restaurando la complementariedad

Los investigadores diseñaron cebadores para complementar los cebadores Freed, basándolos en las variantes que habían encontrado durante su análisis. Estos luego se agregaron a los conjuntos de imprimaciones Freed a la misma concentración molar, lo que mejoró la profundidad promedio de cobertura para el amplicón 21 y 25 a los niveles logrados con el linaje no P.1.

La profundidad de cobertura de Amplicon 25 mejoró, aunque en un grado algo menor, cuando la mezcla se enriqueció con una concentración molar cuatro veces mayor de la nueva imprimación.

Estos resultados se compararon con las mismas muestras secuenciadas por el grupo de cebadores Freed sin picos para asegurar que el picado de los cebadores permitiera secuenciar otros amplicones con la misma profundidad de cobertura. Lo mismo ocurre con los linajes que no son P.1.

Mutaciones de cebadores generalizadas

Luego, los investigadores exploraron el efecto de las mutaciones en todos los demás VOC que circulan actualmente, incluidos B.1.1.7, B.1.351, P.1 y B.1.617, utilizando tanto el grupo de cebadores Freed como el cebador ARTIC (v.3). piscina. Descubrieron que ambos esquemas mostraban un rendimiento deficiente debido a no menos de 46 variantes en los sitios de los cebadores.

De estos, 34 afectaron al ARTIC y 12 al protocolo Freed. El mayor efecto sobre el primero se debe probablemente a que utiliza amplicones más pequeños, lo que significa que se necesitan más cebadores en general para amplificar todo el genoma. Esto es más propenso a alteraciones de la secuenciación inducidas por mutaciones.

Los amplicones más largos reducen el efecto de las mutaciones del sitio del cebador individual, pero si uno se ve afectado, se ve afectado un tramo más grande del genoma. Por lo tanto, los pros y los contras de un esquema de cebador deben tenerse en cuenta al amplificar fragmentos de ARN viral.

Había cinco variantes que afectaban a la secuenciación del linaje B.1.1.7, nueve para el VOC B.1.351, mientras que los linajes B.1.617 + y P.1 mostraban 16 variantes de cebadores. Muchas de estas variantes dominaron su linaje, como lo demuestra el hecho de que con 12 de ellos, el 90% de los aislados secuenciados para ese linaje contenían la variante de interés.

¿Cuáles son las implicaciones?

El estudio muestra la naturaleza crucial de los efectos producidos por mutaciones en el sitio del cebador durante un protocolo de amplificación. Esto significa que se deben rastrear los linajes más nuevos para identificar tales mutaciones.

Como parte de este proceso, los efectos reales de las variantes de cebadores deben validarse sobre la base de datos de laboratorio.

Mediante el uso de un programa bioinformático ya disponible, los investigadores pudieron descubrir la presencia de tres mutaciones que están presentes en una proporción sustancial del linaje P.1. También pudieron corregir parcialmente las brechas en la profundidad de la cobertura de la secuencia agregando imprimaciones de diseño.

Utilizando el mismo programa PCR_strainer, también encontraron una gran cantidad de variantes de cebadores que interrumpen estos protocolos de secuenciación de uso común y se encuentran en muchos VOC circulantes.

El equipo concluye:

Nuestros resultados sugieren que las actualizaciones extensivas para los esquemas de secuenciación de amplicones ampliamente utilizados son necesarias de inmediato, y que los esquemas de cebadores tendrán que evolucionar junto con el SARS-CoV-2. A largo plazo, nuestra combinación de análisis PCR_strainer y validación de laboratorio proporciona un enfoque útil para mantener los protocolos de secuenciación clínica del SARS-CoV-2. “

*Noticia importante

medRxiv publica informes científicos preliminares que no son revisados ​​por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, guiar la práctica clínica / comportamiento relacionado con la salud o tratarse como información establecida.

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