Los investigadores desarrollan un biosensor innovador que puede detectar y cuantificar la infección por SARS-CoV-2


Las acciones de un fármaco o un objetivo molecular. in vitro a menudo no se traducen en un celular o en vivo contexto. La permeabilidad de la membrana, los efectos fuera del objetivo y la citotoxicidad son algunos de los factores que pueden contribuir a esta diferencia. Este es un gran cuello de botella en el esfuerzo por identificar con urgencia nuevas terapias antivirales, especialmente a raíz de la pandemia de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19).

El agente etiológico de COVID-19 es el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Ha infectado a más de 123,5 millones de vidas y ha causado más de 2,7 millones de muertes. El único agente antiviral más prometedor contra el SARS-CoV-2 que se usa actualmente en la clínica es el inhibidor de la ARN polimerasa dependiente de ARN remdesivir. Sin embargo, ha presentado resultados y efectos secundarios mixtos.

Estudio: Biosensores activables por proteasa de la infección por SARS-CoV-2 para ensayos de neutralización, virológicos y de fármacos basados ​​en células.  Crédito de la imagen: NIAID / Flickr

Si bien ahora se administran vacunas eficaces contra el SARS-CoV-2 en muchas partes del mundo, se sospecha que el virus puede persistir y continuar infectando a los seres humanos. Además, las variantes emergentes pueden contribuir a la circulación e infección del virus.

Para combatir este brote de SAR-CoV-2 y cualquier potencial zoonótico futuro coronavirus, es fundamental contar con herramientas eficientes – ensayos bioquímicos directos – que proporcionen información fisiológicamente más relevante y permitan el estudio de fenotipos terciarios complejos como la replicación viral.

Actualmente, las pruebas de neutralización por reducción de placa convencionales (PRNT) son el estándar de oro para la cuantificación de la replicación viral. Sin embargo, el bajo rendimiento y el largo tiempo de respuesta de estos ensayos limitan su utilidad para el cribado a gran escala de fármacos o sueros.

Para satisfacer una necesidad urgente de un ensayo basado en células simple y de alto rendimiento, para cuantificar la infección por SARS-CoV-2 auténtica y nuevas variantes clínicas, los investigadores aprovecharon la presencia de actividad de proteasa viral. Las proteasas del SARS-CoV-2 son dianas terapéuticas atractivas.

En un nuevo estudio publicado recientemente en el bioRxiv* servidor, generaron biosensores fluorescentes y luminiscentes activables por proteasa para la actividad de SARS-CoV-2 MPro (proteasa principal) y PLPro (proteasa similar a la papaína), uno basado en “flip” GFP (FlipGFP) y el otro basado en permutación circular luciferasa de luciérnaga (FFluc). El equipo, de la Universidad de Cambridge y el NHS Blood and Transplant, Cambridge, Reino Unido, desarrolló una línea celular informadora luminiscente sensible que cuantifica con precisión el virus infeccioso SARS-CoV-2.

En comparación con los virus informadores fluorescentes o luminiscentes de ingeniería inversa, una ventaja clave de nuestra línea celular informadora luminiscente es el potencial para detectar una variedad de aislados clínicos de SARS-CoV-2, incluidas las variantes emergentes de preocupación “.

Los investigadores confirmaron la especificidad y utilidad de estos reporteros usando proteasas virales recombinantes. Establecieron que estos reporteros podían detectar y cuantificar las células infectadas.

Finalmente, desarrollaron una línea celular indicadora luminiscente estable, en la que FFluc es activado por la expresión de PLPro durante la infección por SARS-CoV-2. Demostraron la utilidad de estas células en ensayos de antivirales de molécula pequeña y anticuerpos neutralizantes utilizando un SARS-CoV-2 de tipo salvaje.

En este trabajo, demostraron su utilidad para el cribado de fármacos y la titulación de anticuerpos neutralizantes.

Después de que los investigadores generaron reporteros de proteasa SARS-CoV-2 basados ​​en FlipGFP, probaron si estos biosensores podían detectar la actividad de la proteasa SARS-CoV-2 en las células. De los tres reporteros estudiados aquí, observaron la señal más fuerte del reportero PLP2-FlipGFP.

Además, también confirmaron que los biosensores de SARS-CoV-2 seleccionados son específicos para sus proteasas afines y se activan de una manera estrictamente dependiente de la secuencia.

Los datos de este estudio respaldaron el principio de que los ensayos basados ​​en células para compuestos antivirales se correlacionan mejor con la actividad contra la replicación viral que los ensayos in vitro, afirmaron los investigadores.

Usando la línea celular HEK293T que sobreexpresa ACE2 y furina (llamadas células HEK293T-ACE2), los investigadores demostraron que durante una infección por SARS-CoV-2, la expresión de proteasa viral activaba los reporteros basados ​​en FlipGFP. Por tanto, los biosensores activables por proteasa pueden explotarse para señalar la infección por SARS-CoV-2. Sin embargo, el estudio señaló que no pudo demostrar una ventana utilizable para experimentos de alto rendimiento.

Generaron un reportero de proteasa SARS-CoV-2 basado en luciferasa que puede cuantificar la infección por SARS-CoV-2, y también desarrollaron un ensayo luminiscente fácil para detectar los inhibidores de la replicación del SARS-CoV-2.

Usando este ensayo basado en células, los investigadores diferenciaron, a partir de un panel de inhibidores, entre compuestos que pueden inhibir la replicación viral (GC373 y GC376) y aquellos que no lo son (carmofur, disulfiram, PX-12, tideglusib).

Para una línea celular indicadora luminiscente sensible para fármacos, neutralización y ensayos virológicos generales, los investigadores desarrollaron una línea celular estable, células HEK293T-ACE2-30F-PLP2; utilizado con una lectura luminiscente simple.

La primera línea celular indicadora luminiscente estable para la infección por SARS-CoV-2 generada en este estudio es ideal para cribados de alto rendimiento de compuestos antivirales candidatos o anticuerpos terapéuticos y / o estudios serológicos a gran escala para neutralizar la actividad contra virus auténtico.

En conclusión, los investigadores de este estudio han desarrollado un conjunto de herramientas versátil de reporteros fluorescentes y luminiscentes basados ​​en células activados por proteasas del SARS-CoV-2.

Nuestros datos establecen la viabilidad de los biosensores activables por proteasa para la detección de la infección por SARS-CoV-2 y demuestran la utilidad práctica de una línea celular indicadora basada en luciferasa para la cuantificación de células infectadas, pruebas de drogas y ensayos serológicos ”.

*Noticia importante

bioRxiv publica informes científicos preliminares que no son revisados ​​por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, guiar la práctica clínica / comportamiento relacionado con la salud o tratarse como información establecida.

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