Los investigadores desarrollan un ensayo RT-LAMP de bajo costo optimizado para la saliva para una detección más rápida del SARS-CoV-2


La pandemia del síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ha puesto de relieve las deficiencias en la respuesta de emergencia a nivel mundial y ha impulsado una demanda masiva de tecnologías de pruebas de diagnóstico in vitro.

Estudio: Desarrollo de un ensayo RT-LAMP optimizado para saliva para el SARS-CoV-2.  Haber de imagen: sdecoret / Shutterstock

La tecnología cuantitativa de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR) se está utilizando ampliamente como prueba de diagnóstico para la detección del SARS-CoV-2, pero no satisface de manera óptima las necesidades de diagnóstico a gran escala de esta pandemia mundial sin precedentes. Los largos tiempos de respuesta, la complejidad, la escasez de la cadena de suministro y el alto costo son algunas de las desventajas de RT-qPCR que disminuyen su eficiencia y dificultan el acceso a las pruebas.

Muchos países se están adaptando y desarrollando tecnologías moleculares para superar estas deficiencias. Amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP) es una de ellas y puede ser una alternativa viable a la tecnología qPCR para abordar las necesidades de diagnóstico de la pandemia COVID-19.

La técnica RT-LAMP y su principio

LAMP es una técnica de detección que funciona en el mismo ácido nucleico principio de amplificación como PCR. Sin embargo, LAMP es una tecnología isotérmica y no necesita termocicladores, que cuestan varios miles de dólares. Por lo tanto, RT-LAMP utiliza un equipo mínimo en comparación con RT-qPCR y es una mejor alternativa a los métodos de prueba utilizados actualmente.

La prueba LAMP requiere al menos 4 (y hasta 6) cebadores diferentes, de los cuales 2 contienen una región autocomplementaria que produce un bucle monocatenario perpetuo y 2 se dirigen a la región en la estructura del bucle monocatenario. Por tanto, LAMP puede producir cantidades detectables de ADN casi al mismo tiempo que la PCR pero a una sola temperatura de reacción. La detección de ADN se puede lograr mediante diferentes métodos, como la turbidez o mediante el uso de un tinte fluorescente.

Los esfuerzos de detección anteriores se han centrado en el uso de detección colorimétrica de productos de amplificación utilizando un colorante de pH o un indicador de magnesio. Los cambios de color producidos por estos tintes, aunque adecuados, tienen un contraste visible limitado y, a menudo, pueden ser ambiguos.

LAMPShade Violet ofrece una mejor claridad visual y limita la ambigüedad

Para abordar los problemas anteriores, investigadores de los EE. UU. Utilizaron recientemente el nuevo colorante de pH LAMPShade Violet (LSV) en RT-LAMP. LSV tiene un mejor contraste visual entre pH alto y bajo y un punto de inflexión más fuerte, los cuales permiten una fácil interpretación de los resultados y reducen la ambigüedad. Su estudio se ha publicado en el servidor de preimpresión, medRxiv*.

Para la detección de SARS-CoV-2, los investigadores utilizaron saliva como muestra respiratoria en lugar de hisopos nasofaríngeos. El muestreo de saliva es mucho más fácil en comparación con la recolección de hisopos nasofaríngeos. Estudios anteriores han confirmado la compatibilidad de la saliva con las pruebas de RT-LAMP incluso en ausencia de purificación de ARN. El equipo agregó un paso de inactivación que normaliza el pH, inactiva las ARNasas y libera ARN. Sin embargo, dado que la saliva es heterogénea en diferentes individuos, no es posible una estrategia de inactivación única para todos.

Nuestros resultados de optimización de la purificación también sugieren varias direcciones inexploradas para futuros diagnósticos de ácidos nucleicos basados ​​en saliva “.

Por lo tanto, optimizaron un protocolo de inactivación con mayor éxito en muestras de saliva heterogéneas combinadas con LAMPShade Violet. Desarrollaron un protocolo de purificación de ARN de 10 minutos a partir de saliva y lo llamaron protocolo de perlas magnéticas SalivaBeads. También desarrollaron una barra magnética (MS), StickLAMP, que ofrece una purificación confiable de ARN basada en perlas y un acceso simple y de bajo costo a las pruebas de muestras de saliva.

“MS también tiene varias ventajas sobre el otro método tradicional de separación de perlas, la purificación de la rejilla magnética”.

Varias características de la purificación SalivaBeads.  (a) Una comparación de la uniformidad del color de la muestra antes de la incubación en 12 muestras, con reacciones de SARS-CoV-2 y Actina una al lado de la otra.  La entrada directa de saliva inactivada en una reacción comercial basada en rojo fenol se compara con una entrada de ARN purificado con SalivaBeads en nuestra reacción basada en LAMPShade Violet.  (b) Una comparación del ARN del SARS-CoV-2 recuperado de muestras de saliva artificial por qPCR N1, medido por el número de copias recuperadas por qPCR dividido por el número de copias creadas en saliva.  (c) Una comparación visual de los desechos unidos a las perlas magnéticas al aislar las perlas mediante una rejilla magnética (izquierda) o una varilla magnética (derecha).  (d) Una comparación de la sensibilidad entre SalivaBeads purificadas mediante una rejilla magnética (izquierda) y una barra magnética (derecha), por RT-LAMP con LAMPShade Violet.

Varias características de la purificación SalivaBeads. (a) Una comparación de la uniformidad del color de la muestra antes de la incubación en 12 muestras, con reacciones de SARS-CoV-2 y Actina una al lado de la otra. La entrada directa de saliva inactivada en una reacción comercial basada en rojo fenol se compara con una entrada de ARN purificado con SalivaBeads en nuestra reacción basada en LAMPShade Violet. (b) Una comparación del ARN del SARS-CoV-2 recuperado de muestras de saliva artificial por qPCR N1, medido por el número de copias recuperadas por qPCR dividido por el número de copias creadas en saliva. (c) Una comparación visual de los desechos unidos a las perlas magnéticas al aislar las perlas mediante una rejilla magnética (izquierda) o una varilla magnética (derecha). (d) Una comparación de la sensibilidad entre SalivaBeads purificadas mediante una rejilla magnética (izquierda) y una barra magnética (derecha), por RT-LAMP con LAMPShade Violet.

Protocolos de bajo costo ideales para áreas de bajos recursos que luchan por contener la propagación del SARS-CoV-2

Según los autores, los protocolos de detección de SARS-CoV-2 que desarrollaron son rentables, a menos de $ 5 / prueba sin tener en cuenta la mano de obra y la combinación de muestras, y proporcionan una mejor escalabilidad en comparación con los protocolos existentes sin afectar la sensibilidad de las pruebas. . Los autores agregaron que los nuevos protocolos son ideales para escuelas o lugares de trabajo con una pequeña cantidad de estudiantes o empleados en el rango de menos de 10 a miles. El bajo costo de los nuevos protocolos los hace adecuados para entornos de bajos recursos y desatendidos que se han visto afectados de manera desproporcionada por la pandemia del SARS-CoV-2.

Los requisitos mínimos de equipo y el bajo costo también los hacen adecuados para entornos de bajos recursos, que aún podrían montar un laboratorio CLIA de complejidad media ”.

*Noticia importante

medRxiv publica informes científicos preliminares que no son revisados ​​por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, guiar la práctica clínica / comportamiento relacionado con la salud o tratarse como información establecida.

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