Los investigadores desarrollan un genoma sintético defectuoso del SARS-CoV-2 que inhibe la replicación viral

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Un genoma más corto que comprende solo una parte del genoma de ARN del SARS-CoV-2 compite con el virus normal por el crecimiento y puede prevenir potencialmente la replicación viral.

El impacto devastador de la pandemia de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), causada por el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2), ha llevado a importantes esfuerzos para frenar su transmisión. Cuando los virus de ARN, como el SARS-CoV-2, se replican, puede haber versiones del virus que tengan grandes deleciones en el genoma viral, lo que hace que el virus sea defectuoso. Estos genomas defectuosos aún pueden replicarse en presencia del virus de longitud completa. Debido a que son más cortos, pueden replicarse más rápido que el virus original y competir con el virus completo por la replicación, interrumpiendo el crecimiento y la propagación del virus.

Representación 3D del microbio SARS-CoV-2 con molécula de ARN en el interior.  Haber de imagen: Vchal / Shutterstock

Representación 3D del microbio SARS-CoV-2 con molécula de ARN en el interior. Haber de imagen: Vchal / Shutterstock

Estos genomas de interferencia defectuosa (DI) son comunes en coronavirus, pero aún no se ha informado DI para el SARS-CoV-2. Generalmente se cree que las partículas DI son el resultado de una replicación ineficaz o que tienen funciones reguladoras. Investigadores de la Universidad Estatal de Pensilvania, EE. UU., Han desarrollado una construcción DI sintética para el SARS-CoV-2 e informaron sus hallazgos en un nuevo estudio publicado en bioRxiv* servidor de preimpresión.

Un genoma interferente defectuoso sintético

Prepararon genomas de DI sintéticos a partir de partes del genoma del SARS-CoV-2 y probaron si los genomas de DI podían replicarse en células infectadas tanto con el genoma sintético como con el virus de tipo salvaje (WT).

Hicieron su construcción utilizando tres porciones del genoma del virus: la parte 5 ‘UTR y la parte 5’ de la proteína no estructural 1 (nsp1) en ORF1a, una parte de nsp15 con la señal de empaquetamiento y la secuencia de la 3 ‘ parte de la secuencia N, ORF10 y 3’UTR. El genoma de DI sintético tenía 2882 nucleótidos (nt) de longitud, aproximadamente el 9,6% de la longitud del genoma del virus WT. Además, los autores también prepararon un segundo genoma sintético más corto de aproximadamente 800 nt de largo sin la porción de empaque.

El equipo preparó los dos genomas como ADN y los insertó en plásmidos, transcribiéndolos. in vitro para hacer los ARN. Los ARN preparados se insertaron en células Vero-E6 infectadas con SARS-CoV-2.

Debido a que los genomas de DI sintéticos se degradan rápidamente y no se replican bien, los autores no pudieron estudiar cómo se replicaron. Sin embargo, el genoma DI con las tres porciones redujo la replicación del SARS-CoV-2 aproximadamente a la mitad, 24 horas después de la transfección. El genoma DI más corto no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento del SARS-CoV-2.

DI reduce la cantidad de SARS-CoV-2 a la mitad;  se replica 3 veces más rápido;  y se transmite con la misma eficacia.  Amarillo: DI en coinfecciones;  azul: WT en coinfecciones;  gris: WT en infecciones sin DI.  a: Tasas de crecimiento (cantidad absoluta relativa a la cantidad a las 4 horas) de WT en controles y en coinfecciones;  crecimiento en relación con los controles en el mismo momento;  y detalle a las 24 horas.  b: 24 horas después de la infección, se utilizó el sobrenadante para infectar nuevas células.  La eficiencia de transmisión es la cantidad medida por qRT-PCR inmediatamente antes del pase dividida por la cantidad media medida casi inmediatamente (4 horas) después del pase.  c: Tasas de crecimiento (cantidad absoluta relativa a la cantidad a las 4 horas) de WT en controles y en coinfecciones;  crecimiento en relación con los controles en el mismo momento;  y detalle a las 24 horas.  Tasas de crecimiento (cantidad absoluta relativa a la cantidad a las 4 horas) de WT y DI en coinfecciones;  crecimiento relativo al de WT en coinfecciones en el mismo momento;  y detalle a las 24 horas.

DI reduce la cantidad de SARS-CoV-2 a la mitad; se replica 3 veces más rápido; y se transmite con la misma eficacia. Amarillo: DI en coinfecciones; azul: WT en coinfecciones; gris: WT en infecciones sin DI. a: Tasas de crecimiento (cantidad absoluta relativa a la cantidad a las 4 horas) de WT en controles y en coinfecciones; crecimiento en relación con los controles en el mismo momento; y detalle a las 24 horas. b: 24 horas después de la infección, se utilizó el sobrenadante para infectar nuevas células. La eficiencia de transmisión es la cantidad medida por qRT-PCR inmediatamente antes del pase dividida por la cantidad media medida casi inmediatamente (4 horas) después del pase. c: Tasas de crecimiento (cantidad absoluta relativa a la cantidad a las 4 horas) de WT en controles y en coinfecciones; crecimiento en relación con los controles en el mismo momento; y detalle a las 24 horas. Tasas de crecimiento (cantidad absoluta relativa a la cantidad a las 4 horas) de WT y DI en coinfecciones; crecimiento relativo al de WT en coinfecciones en el mismo momento; y detalle a las 24 horas.

Un día después de la transfección, el equipo infectó nuevas células utilizando el sobrenadante. Se observó que tanto el virus WT como el genoma DI comenzaron cuatro horas después de la infección, pero no vieron el genoma DI sin la porción de empaque. No hubo diferencia en la tasa de transmisión del genoma DI y el virus WT, lo que sugiere que el genoma DI más corto es tan infeccioso como el virus WT.

En las muestras infectadas tanto con el genoma DI como con el virus regular, el número de viriones regulares disminuyó a la mitad en 24 horas. El genoma DI aumentó aproximadamente tres veces más rápido que el virus WT. Los resultados sugieren que incluso una pequeña cantidad de genoma DI puede afectar fuertemente la replicación del virus WT.

El genoma defectuoso compite con el virus normal durante el crecimiento

Los autores también modelaron la dinámica del sistema para comprender la competencia intracelular entre el genoma DI y el virus normal. De manera similar a las predicciones de modelos anteriores, el genoma DI y el virus WT coexisten si la ventaja de replicación del genoma DI está por debajo de un umbral crítico. Por encima de ese umbral, los genomas DI matarán a todos los virus WT. Este umbral depende del número de genomas dentro del rango de la proteína viral producida por el virus regular.

Por lo tanto, el modelo sugiere que el genoma DI aumentará con el tiempo y acabará con el genoma del virus WT. Sin embargo, dado que los autores midieron solo cinco pases, donde sí vieron un aumento en la proporción del genoma DI a WT, escribieron que no pudieron verificar si esta reducción temprana conduciría a la extinción del virus WT.

“La interferencia con el virus WT es el efecto más notable de nuestra construcción DI”, escriben los autores. Las partículas DI no tienen ningún propósito para el virus WT; más bien, existen como parásitos del virus normal. Debido a que pueden replicarse más rápido que el virus completo cuando están coinfectados con el virus, son adecuados como posibles antivirales.

A medida que avanza la replicación, el genoma DI continúa aumentando en frecuencia y el proceso se vuelve más efectivo, lo que finalmente conduce a la muerte tanto del virus normal como del genoma DI. Aunque las construcciones DI tienen potencial como antivirales, no se han explorado mucho. El VIH y los virus de la influenza no son candidatos ideales para este enfoque, ya que tienen genomas cortos y ciclos de vida complejos. Sin embargo, los coronavirus son ideales para este enfoque, ya que tienen un genoma de ARN monocatenario largo y ciclos de vida simples y podrían explorarse más para el SARS-CoV-2.

*Noticia importante

bioRxiv publica informes científicos preliminares que no son revisados ​​por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, guiar la práctica clínica / comportamiento relacionado con la salud o tratarse como información establecida.

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