Los investigadores desarrollan un método de prueba de saliva para el SARS-CoV-2 mediante extracción robótica de ARN


Los investigadores han desarrollado un método automatizado de extracción de ARN de muestras de saliva para permitir tiempos de procesamiento más rápidos y una alta sensibilidad de la prueba. La prueba de saliva podría usarse como una alternativa a la prueba de hisopo para la vigilancia de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19).

Descripción general de la extracción de ácido nucleico de muestras de saliva: una descripción general de la línea de procesamiento de muestras del Innovative Genomics Institute (IGI) para muestras de hisopos y saliva.  OP = orofaríngeo.  OP-MT = cornete medio orofaríngeo.  b, Se mezcló 1: 1 de SARS-CoV-2 cultivado (1,58x106 TCID50 / ml) con la solución de OMNIgene presente en los tubos de recogida de OM-505 para ensayar las condiciones de incubación que inactivan la replicación viral.  Las muestras se mantuvieron a temperatura ambiente (RT) o se incubaron a 65 ° C durante el tiempo indicado antes de aplicarse a las células Vero-E6.  El efecto citopático (CPE) se cuantificó a los 3 y 7 días después del tratamiento (dpt).  c, la dilución 3: 2 de muestras de saliva con DNA / RNA Shield mejora la detección de ARN o MS2 del SARS-CoV-2 enriquecido en cuatro donantes de saliva.

Visión general de ácido nucleico extracción de muestras de saliva – a, Descripción general del proceso de procesamiento de muestras del Innovative Genomics Institute (IGI) para muestras de hisopos y saliva. OP = orofaríngeo. OP-MT = cornete medio orofaríngeo. b, Se mezcló 1: 1 de SARS-CoV-2 cultivado (1,58×106 TCID50 / ml) con la solución de OMNIgene presente en los tubos de recogida de OM-505 para probar las condiciones de incubación que inactivan la replicación viral. Las muestras se mantuvieron a temperatura ambiente (RT) o se incubaron a 65 ° C durante el tiempo indicado antes de aplicarse a las células Vero-E6. El efecto citopático (CPE) se cuantificó a los 3 y 7 días después del tratamiento (dpt). c, la dilución 3: 2 de muestras de saliva con DNA / RNA Shield mejora la detección de ARN o MS2 del SARS-CoV-2 enriquecido en cuatro donantes de saliva.

Muchos casos de COVID-19, la enfermedad causada por el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2), son asintomáticos. La detección de estos casos asintomáticos es importante para frenar la propagación de la enfermedad.

Las pruebas de SARS-CoV-2 generalmente las realizan los médicos mediante la recolección de muestras de saliva o hisopos nasales o de garganta. Sin embargo, dado que esto puede llevar mucho tiempo y ser costoso, varios laboratorios han estudiado recientemente el uso de muestras recolectadas por ellos mismos. La saliva es una opción atractiva ya que es más fácil de recolectar y se ha demostrado que detecta el ácido ribonucleico (ARN) del SARS-CoV-2, que es su material genético. La auto-recolección de muestras de saliva aumentará las muestras recolectadas en una población, pero también requerirá métodos de análisis más rápidos.

Varias pruebas de saliva usan RT-qPCR directa, eliminando la extracción de ácido nucleico, pero esto reduce la sensibilidad. Para permitir pruebas más rápidas de SARS-CoV-2 en la saliva mientras se mejora la sensibilidad, investigadores de la Universidad de California, Berkeley y el Laboratorio Clínico del Sistema de Atención Médica del Hospital Washington en California informan sobre un método de extracción automatizado para el ARN del SARS-CoV-2 en saliva. Informaron sus resultados en el medRxiv* servidor de preimpresión.

Extracción robótica de ARN de la saliva

Los participantes en el estudio IGI-FAST en la Universidad de California, Berkeley, recolectaron alrededor de 1 ml de muestra de saliva en tubos de recolección de ADN Genotek OMNIgene en quioscos instalados en el campus. El equipo utilizó un procedimiento de extracción previa en dos pasos, incubando las muestras a 50 ° C durante dos horas y a 65 ° C durante 30 minutos, para inactivar el virus.

Para la extracción de ARN y placas de muestras robóticas, los autores diluyeron la muestra de saliva en una solución que altera la estructura del ADN, o una solución caotrópica. Esto permitió una mejor detección de ARN.

Usando muestras de saliva de participantes COVID-19 negativos, los investigadores determinaron el límite de detección del ensayo agregando un ARN de control positivo o virus SARS-CoV-2 inactivado a las muestras. Descubrieron que el ensayo podía detectar hasta 3000 copias de ARN / ml y una dosis infecciosa de cultivo de tejidos del 50% (TCID50) / ml. El equipo probó 20 muestras más con ARN de virus agregado para confirmar la solidez del método de prueba robótico.

Luego, el equipo probó su procedimiento de laboratorio en un entorno del mundo real (en el campus), utilizando el estudio IGI-FAST. El estudio se realizó de junio a octubre de 2020, con la participación de 3.653 participantes y alrededor de 12.000 muestras de saliva. Durante las primeras tres semanas, alrededor del 6% de las muestras dieron errores durante la prueba. Entonces, el equipo modificó su procedimiento de laboratorio para hacerlo más robusto.

Aunque el equipo analizó muestras de saliva agrupadas, encontraron muchos errores de muestra insuficiente, lo que anula las ventajas de agrupar las muestras. Además, aumentó los tiempos de respuesta de las pruebas y fue logísticamente difícil de administrar. Por lo tanto, el equipo volvió a analizar muestras de saliva individuales.

Los autores compararon su prueba de saliva con muestras nasofaríngeas de los mismos individuos; este último probado usando métodos estándar y el método robótico. Hubo aproximadamente un 73% de concordancia positiva entre el hisopo y las muestras de saliva.

Lo bueno y lo malo de probar la saliva

Los resultados permitieron al equipo identificar varias ventajas y desventajas de analizar la saliva para el SARS-CoV-2. La extracción y procesamiento automatizados de ácidos nucleicos de la saliva fue muy sensible, pero la calidad de la saliva fue muy variable, lo que afecta los procesos de extracción y amplificación. Además, las cantidades de muestras de saliva eran insuficientes en comparación con los hisopos de nariz y garganta, lo que impedía el análisis de muestras agrupadas.

Los autores y otros han descubierto que las muestras de saliva analizadas dos o más días después de la recolección son más fáciles de extraer y procesar. Por lo tanto, “Una conclusión clave de este trabajo es la importancia de realizar experimentos de validación con muestras de saliva recién recolectadas de la población objetivo para garantizar que el rendimiento del ensayo se evalúe de acuerdo con las aplicaciones del ensayo en el mundo real”, escriben los autores.

Las muestras de saliva también fueron clínicamente menos sensibles que las muestras de hisopo. Esto podría deberse a la variación en las cargas virales en diferentes sitios del cuerpo o la etapa de la infección durante el período de recolección de la muestra. Los autores también tuvieron dificultades para obtener el consentimiento de los pacientes hospitalizados, ya que muchos eran demasiado débiles para proporcionar una muestra. Por tanto, la recogida de muestras de saliva requiere la participación activa del paciente. Varios otros laboratorios también han tenido dificultades para analizar muestras de saliva y continuaron analizando hisopos.

A pesar de los desafíos, los autores escriben que la prueba de saliva es una alternativa importante y complementaria a las pruebas con hisopo. El equipo continúa ofreciendo su prueba de saliva como método de vigilancia en el campus de UC Berkeley, que generalmente se proporciona como una prueba en el hogar para permitir la realización de pruebas a grupos objetivo más pequeños o personas que no pueden tolerar las pruebas con hisopo.

*Noticia importante

medRxiv publica informes científicos preliminares que no son revisados ​​por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, guiar la práctica clínica / comportamiento relacionado con la salud o tratarse como información establecida.

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