Los investigadores desarrollan un método para detectar SARS-CoV-2 y variantes simultáneamente


Los investigadores demuestran un método para detectar la presencia y mutaciones en el virus del síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) utilizando el secuenciador Oxford Nanopore más pequeño y económico, un método que creen que podría hacer que la vigilancia de la pandemia sea más rápida y económica.

La pandemia de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) ha dado lugar a grandes esfuerzos de investigación en el diagnóstico viral. Se han desarrollado nuevos métodos para reducir el tiempo y el costo del diagnóstico, aumentar la sensibilidad y la especificidad y permitir que se lleven a cabo métodos de diagnóstico a gran escala.

Estudio: Diagnóstico y seguimiento de variantes de SARS-CoV-2 en tiempo real sobre múltiples candidatos mediante secuenciación de ADN de nanoporos.  Haber de imagen: vchal / Shutterstock

Se propusieron varias estrategias que utilizaban secuenciación masiva de ADN en paralelo para diagnósticos a gran escala. Estos métodos utilizaron códigos de barras moleculares de ADN durante la preparación de la muestra, agrupando las muestras para realizar el ensayo “en una sola ejecución” y desglosando los resultados mediante el procesamiento bioinformático.

Estos métodos podrían realizar diagnósticos para más de mil muestras por ensayo. Sin embargo, necesitan máquinas de secuenciación de ADN especializadas, como el secuenciador Ilumina, que deben ser ejecutadas por ingenieros capacitados, lo que las hace muy costosas.

En un estudio publicado en el medRxiv* servidor de preimpresión, investigadores de Universidad Paris-Saclay en Francia describen una prueba de concepto de un método de diagnóstico y seguimiento a gran escala para diferentes variantes del síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) utilizando la secuenciación de ADN realizada en la tecnología MinION Oxford Nanopore Technology (ONT). Estos secuenciadores son portátiles, de bajo costo y fáciles de usar, por lo que pueden usarse en entornos remotos y de bajo costo.

Prueba de SARS-CoV-2

Para realizar sus diagnósticos de SARS-CoV-2, el equipo combinó un ensayo de transcripción inversa estándar con amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para generar fragmentos de ADN largos. Esto les permitió apuntar a fragmentos cortos de ADN y, al mismo tiempo, aprovechar la capacidad del secuenciador para secuenciar fragmentos largos. Durante la transcripción inversa, se agrega un fragmento único para cada muestra además del fragmento específico de COVID-19, lo que permite la identificación de cada muestra.

Durante la amplificación por PCR, se agrega otro fragmento molecular único o código de barras a cada muestra. Esto puede aumentar el número de muestras analizadas sin tener que aumentar linealmente el número de cebadores.

A diferencia de los secuenciadores de Illumina que proporcionan secuencias solo al final de todo el proceso, los secuenciadores Oxford Nanopore pueden proporcionar secuencias de forma continua. El equipo diseñó un método para recopilar secuencias generadas cada pocos minutos, lo que permite un análisis más en tiempo real de las muestras. Usando una muestra sintética de control de ARN del SARS-CoV-2, el equipo validó su estrategia y pudieron detectar hasta 10 copias virales de la muestra.

Además, probaron su método ejecutando la secuenciación durante 72 horas durante aproximadamente cuatro millones de lecturas de secuencia. A partir de estos, los autores pudieron obtener 14.000 secuencias óptimas, lo que les permitió detectar copias virales de ARN hasta una dilución de 100 veces, lo que corresponde a 100 copias en el ensayo de PCR.

Detectando variantes

Además de las pruebas de diagnóstico, el método también se puede utilizar para detectar variantes en un único ensayo. Los investigadores utilizaron una combinación de ARN humano de cultivos de líneas celulares y el ARN sintético, incluido el ARN sintético correspondiente a las cepas B.1.1.7 y HF2393 SARS-CoV-2.

Para detectar variantes virales, la secuenciación se centró en el gen SPIKE del SARS-CoV-2 en lugar de en todo el genoma del virus porque la mayoría de las variaciones se ubicaron en la región de la espiga. Esto les permitió analizar más muestras, aproximadamente 10 veces la cobertura de secuenciación actual, lo que agilizó el proceso.

Esquema que ilustra la estrategia propuesta de seguimiento de variantes y diagnóstico de SARS-CoV-2 en tiempo real.  Las muestras de ARN aisladas de múltiples candidatos se convierten en ADN complementario (ADNc), de modo que las muestras asociadas a cada candidato se etiquetan mediante códigos de barras de ADN molecular adjuntos a sus extremidades.  Las muestras de ADNc con código de barras se agrupan y se amplifican por PCR en presencia de una secuencia puente (azul) que permite generar concatémeros.  Los concatémeros de ADN largos se cargan en el secuenciador de nanoporos MinION para el diagnóstico de SARS-CoV-2 en tiempo real y el seguimiento de variantes con la ayuda de RETIVAD.

Esquema que ilustra la estrategia propuesta de seguimiento de variantes y diagnóstico de SARS-CoV-2 en tiempo real. Las muestras de ARN aisladas de múltiples candidatos se convierten en ADN complementario (ADNc), de modo que las muestras asociadas a cada candidato se etiquetan mediante códigos de barras de ADN molecular adjuntos a sus extremidades. Las muestras de ADNc con código de barras se agrupan y se amplifican por PCR en presencia de una secuencia puente (azul) que permite generar concatémeros. Los concatémeros de ADN largos se cargan en el secuenciador de nanoporos MinION para el diagnóstico de SARS-CoV-2 en tiempo real y el seguimiento de variantes con la ayuda de RETIVAD.

Las muestras de control negativo tenían el menor número de recuentos alineados para la región SPIKE y E-Sarbeco (cebadores que definen el gen E del virus). Mientras tanto, las muestras con las concentraciones más altas de ARN viral mostraron el mayor número de lecturas alineadas con estas regiones.

Otro enfoque descrito recientemente para detectar variantes usando secuenciación utilizó 42 pares de cebadores para generar fragmentos de 400 nucleótidos. La tecnología desarrollada con el secuenciador Nanopore utiliza solo cuatro cebadores dirigidos a la región SPIKE, lo que reduce en gran medida el número de reactivos requerido.

Los autores también utilizaron un enfoque computacional que llaman Detector de variantes en tiempo real (RETIVAD) para proporcionar el resultado del diagnóstico en tiempo real. RETIVAD detectó varias mutaciones en las muestras analizadas, incluida la B.1.1.7 (también conocida como variante del Reino Unido).

Por lo tanto, la tecnología descrita en este estudio es capaz de detectar y rastrear variantes de SARS-CoV-2 simultáneamente en un tiempo mucho más corto y utiliza el secuenciador Oxford Nanopore más pequeño y económico, que permite que el método se use en cualquier lugar de una manera mucho más asequible.

*Noticia importante

medRxiv publica informes científicos preliminares que no son revisados ​​por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, guiar la práctica clínica / comportamiento relacionado con la salud o tratarse como información establecida.

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