Los investigadores desarrollan un nuevo método para trazar la glicosilación de la proteína de pico del SARS-CoV-2


Los investigadores desarrollan un método novedoso, simple y asequible para la toma de huellas dactilares de N-glicanos basado en el etiquetado enzimático fluorescente de glicanos y la electroforesis. Este nuevo método puede ayudarnos a comprender cambios importantes en la glicosilación en la proteína de pico del coronavirus 2 (SARS-CoV-2) del síndrome respiratorio agudo severo, algo que podría informar la investigación terapéutica futura.

Estudio: Huellas dactilares de glicano fluorescente de proteínas de pico del SARS2.  Haber de imagen: Shutterstock / por MattLphotography

Los avances en genómica, proteómica y espectrometría de masas han permitido a los científicos identificar glucanos específicos en proteínas y su asociación con enfermedades. Sin embargo, estos métodos son costosos, requieren expertos altamente capacitados para realizarlos y no están fácilmente disponibles.

Los investigadores Zhengliang L. Wu y James M. Ertelt liberaron los N-glicanos presentes en una glicoproteína y los etiquetaron enzimáticamente con ácido siálico conjugado con fluoróforo y fucosa, y los separaron mediante electroforesis en gel. La huella dactilar del glicano en la proteína se identifica utilizando estándares de glicanos y escaleras de glicanos que se recorren en el gel (para reconocer las identidades de las bandas individuales). Este nuevo método permite una rápida mirada al patrón de glicosilación de cualquier glicoproteína.

Los glicanos son azúcares importantes en las proteínas que desempeñan diversas funciones en la inmunidad, como la modulación de la activación de las células T, la localización de leucocitos y la inmunogenicidad de las proteínas. Se cree que la aberración en la vía de glicosilación causa trastornos autoinmunes. La glicosilación es una modificación postraduccional común que se produce en la membrana y en las proteínas secretadas. Esto aumenta la estabilidad y solubilidad de estas proteínas.

El SARS-CoV-2, el patógeno causante de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), ingresa a las células huésped humanas utilizando su glicoproteína de pico (S) de membrana. La proteína de pico contiene 22 N-glicanos lentejuelas (Motivos NXS / T, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina).

La glicosilación en la proteína espiga camufla los epítopos inmunogénicos de la proteína, protegiéndolos de la neutralización de anticuerpos, lo que permite al virus evadir la respuesta inmune del huésped. El desarrollo de la vacuna para el SARS-CoV-2 se centra en las proteínas que inician la infección.

La proteína de pico es el objetivo principal de las vacunas y un componente crítico de los ensayos serológicos. Por lo tanto, es importante comprender la glicosilación de esta proteína, para lo cual se propone un método nuevo y novedoso.

En este método, los glicanos primero son liberados por la enzima peptídica N-glicosidasa F (PNGasa F), y luego marcados por una sialiltransferasa o fucosiltransferasa con un ácido siálico o fucosa conjugado con fluoróforo, y los O-glicanos en una glicoproteína se etiquetan primero seguido de la digestión con tripsina, y finalmente, los glicanos o glicopéptidos marcados liberados se separan por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE).

N-glicanos de huellas dactilares liberados de varias proteínas Spike del SARS2 con ST6Gal1 (rojo) y FUT8 (verde).  Los N-glicanos de diversas proteínas pico recombinantes liberadas por PNGasa F fueron marcados por ST6Gal1 y FUT8 con (+) o sin (-) pretratamiento de una neuraminidasa (Neu).  Las muestras marcadas se separaron en gel SDS al 17% y se tomaron imágenes con imágenes de proteínas regulares (paneles superiores) o imágenes fluorescentes (paneles medio e inferior en diferentes contrastes).  Las bandas en rojo son glucanos complejos o híbridos marcados con ST6Gal1 (mediante la incorporación de ácido siálico conjugado con Cy5).  Las bandas en verde son glicanos oligo-manosa marcados por FUT8 (mediante la incorporación de Fucose conjugada con AlexaFluor 555).  Para el etiquetado de FUT8, MGAT1 / UDP-GlcNAc también se incluyeron en la mezcla de etiquetado para convertir los glicanos oligo-manosa en los sustratos para FUT8.  Glicanos marcados de Ribonucleasa B, S'1[6]N1, S'1[6]G1 y S'1[6]Se procesaron G1f como referencias en (A) y se corrió una escalera de glucanos con 10 glucanos estándar marcados en (B).  RS, dominio RBD de la proteína Spike de SARS2 expresada en células Sf21;  RC, dominio RBD de la proteína Spike de SARS2 expresada en células CHO;  RH, dominio RBD de la proteína Spike de SARS2 expresada en células HEK293;  SC, proteína Spike de SARS2 completa expresada en células CHO;  Proteína S1H, SARS2 S1 expresada en células HEK293;  SH, Proteína de pico de SARS2 expresada en células HEK293.

N-glicanos de huellas dactilares liberados de varios SARS2 Proteínas de pico con ST6Gal1 (rojo) y FUT8 (verde). Los N-glicanos de diversas proteínas pico recombinantes liberadas por PNGasa F fueron marcados por ST6Gal1 y FUT8 con (+) o sin (-) pretratamiento de una neuraminidasa (Neu). Las muestras marcadas se separaron en gel SDS al 17% y se tomaron imágenes con imágenes de proteínas regulares (paneles superiores) o imágenes fluorescentes (paneles medio e inferior en diferentes contrastes). Las bandas en rojo son glucanos complejos o híbridos marcados con ST6Gal1 (mediante la incorporación de ácido siálico conjugado con Cy5). Las bandas en verde son glicanos oligo-manosa marcados por FUT8 (mediante la incorporación de Fucose conjugada con AlexaFluor 555). Para el etiquetado de FUT8, MGAT1 / UDP-GlcNAc también se incluyeron en la mezcla de etiquetado para convertir los glicanos oligo-manosa en los sustratos para FUT8. Glicanos marcados de Ribonucleasa B, S’1[6]N1, S’1[6]G1 y S’1[6]Se procesaron G1f como referencias en (A) y se corrió una escalera de glucanos con 10 glucanos estándar marcados en (B). RS, dominio RBD de la proteína Spike de SARS2 expresada en células Sf21; RC, dominio RBD de la proteína Spike de SARS2 expresada en células CHO; RH, dominio RBD de la proteína Spike de SARS2 expresada en células HEK293; SC, proteína Spike de SARS2 completa expresada en células CHO; Proteína S1H, SARS2 S1 expresada en células HEK293; SH, Proteína de pico de SARS2 expresada en células HEK293.

Los investigadores encontraron que cuando se agrega un enlace de un monosacárido específico, la movilidad del glicano cambia a un ritmo relativamente constante. Esto además permite a los investigadores deducir las identidades de las bandas etiquetadas.

Para este estudio de huellas dactilares de glucanos, los investigadores examinaron las enzimas marcadoras y optimizaron la concentración de sustrato para la reacción de marcación utilizando glucanos liberados de la proteína del dominio de unión al receptor de la proteína de pico expresada en células CHO como sustratos. Los datos de este estudio sugieren que el RBD expresado en las células HEK293 contiene principalmente glucanos complejos.

Nuestro estudio proporciona evidencia para apoyar que las células huésped determinan los tipos de glucanos unidos a las proteínas de pico de SARS2, lo que implica además que el patrón de glicosilación de la proteína de pico de SARS2 de los pacientes con COVID-19 también podría ser diferente. ”Zhengliang L Wu y James M Ertelt

En este estudio, también muestran que los glicanos de proteínas de pico expresados ​​en células de insectos y células HEK293 son completamente diferentes.

Entre las diversas sialiltransferasas, encontraron que ST6Gal1 y ST3Gal6 daban señales más fuertes. En su estudio de huellas dactilares de N-Glycan de las proteínas de pico de SARS-CoV-2 con ST6Gal1, encontraron la existencia de glicanos sialilados y asialilados en estas proteínas. Cuando el mismo conjunto de muestras de proteína de pico de SARS-CoV-2 se sondaron con ST3Gal6, observaron huellas de glucanos similares pero distintivas. El etiquetado ST3Gal6 también reveló algunas bandas únicas.

Como método de toma de huellas dactilares, el enfoque es el patrón general de glucanos en lugar de las especies de glucanos individuales ”, dicen los investigadores en su artículo.

Aunque la estrategia no permite un análisis de glucanos estructural detallado y específico del sitio, se discuten las ventajas: simple, asequible, conveniente, visualmente informativo, fácil de interpretar, posibilidad de muestreo múltiple, eficiente y cuantitativo.

La técnica actual ampliamente utilizada para el análisis de glucanos es la espectroscopia de masas. Añadiendo énfasis en las ventajas del nuevo método, los investigadores profundizan en las discrepancias encontradas en los datos de espectroscopia de masas sobre glucanos generados en diferentes laboratorios. Para el material de referencia de anticuerpos monoclonales del NIST 8671, analizado por 66 laboratorios de todo el mundo, el número de composiciones de glucanos identificadas por cada laboratorio varía de 4 a 48.

Asimismo, el análisis de espectrometría de masas de la proteína pico reveló que estaba muy modificada con N-glicanos complejos, híbridos y oligomanosa. Sin embargo, los perfiles de glucanos informados por otros variaron enormemente. El método propuesto aquí proporciona una alternativa para la investigación y el análisis de glucanos.

El análisis de glicanos es fundamental para que los investigadores comprendan mejor las funciones biológicas de la glicosilación en individuos glicoproteínas. Los cambios en la glicosilación son a menudo un sello distintivo de los estados patológicos. Nuevas estrategias terapéuticas y diagnósticas que se basan en la glucobiología subyacente.

Los dos investigadores de Bio-techne, R&D Systems, EE. UU., Han abordado una importante metodología en glicobiología que podría acelerar la ciencia.

*Noticia importante

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