Los investigadores proporcionan detalles ultraestructurales de las células epiteliales respiratorias infectadas con SARS-CoV-2


Un equipo de científicos del Reino Unido investigó recientemente los detalles ultraestructurales de los procesos de unión, entrada y gemación del síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2) en el epitelio de las vías respiratorias humanas. Han utilizado cultivos de interfase aire-líquido altamente diferenciados del epitelio de las vías respiratorias para investigar a fondo el ciclo de infección viral. El estudio está disponible actualmente en el bioRxiv* servidor de preimpresión.

Estudio: Conocimiento ultraestructural de la unión, entrada y gemación del SARS-CoV-2 en el epitelio de las vías respiratorias humanas.  Haber de imagen: Juan Gaertner / Shutterstock

Fondo

El SARS-CoV-2, el patógeno causante de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), es un virus de ARN envuelto que pertenece a la familia Coronaviridae. El virus ataca principalmente a las células epiteliales de las vías respiratorias humanas para iniciar la infección. Mecánicamente, el dominio de unión al receptor (RBD) de la subunidad S1 del pico viral glicoproteína se une a la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2), que se expresa de forma ubicua en la superficie apical de las células epiteliales de las vías respiratorias del huésped. A esto le sigue la escisión proteolítica de la subunidad de la espiga S1 / S2 por una serina proteasa TMPRSS2 presente dentro de las células epiteliales de las vías respiratorias. Esto conduce a la disociación de la subunidad S1 y una alteración conformacional en la subunidad S2 para generar un estado post-fusión de la proteína de pico, que a su vez es necesaria para la fusión de la envoltura viral a la membrana plasmática de las células epiteliales. Tras la fusión, los componentes virales se liberan del lumen viral al citoplasma de la célula huésped para iniciar la replicación viral.

La evidencia sugiere que la replicación viral ocurre en los sitios perinucleares donde se forman las vesículas de doble membrana derivadas del retículo endoplásmico. Las vesículas enriquecidas con ARN bicatenario están asociadas con la replicación viral. Aunque existe evidencia que sugiere que la gemación del SARS-CoV-2 ocurre en los compartimentos intermedios del retículo endoplásmico a Golgi, la ruta exacta desde la vesícula de doble membrana hasta la gemación viral para liberar el virión de las células aún no se conoce completamente.

En el estudio actual, los científicos han investigado la ultraestructura de las células epiteliales de las vías respiratorias humanas infectadas con tres variantes del SARS-CoV-2, incluidas B.1.1.7, B.1.258 y B.1.117.19.

Diseño del estudio

Usando varios métodos de cultivo celular, los científicos desarrollaron cultivos de interfaz aire-líquido altamente diferenciados de células epiteliales de las vías respiratorias humanas recolectadas de muestras de cepillado nasal de individuos sanos e infectados con SARS-CoV-2. En otras palabras, al diferenciar las células epiteliales en una interfaz aire-líquido, desarrollaron una capa epitelial que contiene células ciliadas, caliciformes y basales.

Después de infectar las células epiteliales con tres variantes virales diferentes, examinaron los detalles estructurales de los procesos de adhesión, entrada y gemación viral mediante microscopía electrónica de transmisión, tomografía electrónica y tinción por inmunofluorescencia.

Observaciones importantes

Las imágenes de microscopía electrónica tomadas 72 horas después de la infección revelaron que la mayoría de los viriones presentes en el espacio extracelular estaban adheridos a la membrana plasmática de las células epiteliales. La presencia de proteína de pico se observó en la mayoría de los viriones presentes en el espacio extracelular o dentro de los compartimentos que contienen virus (VC). Curiosamente, no se notó ninguna diferencia en la ultraestructura entre las células infectadas con tres variantes virales diferentes.

Se encontró que ACE2 y TMPRSS2 se localizan específicamente en la base y alrededor de las microvellosidades presentes en la membrana celular. Sin embargo, no se observó la presencia de estas proteínas en los cilios. De manera similar, se encontró que la mayoría de los viriones extracelulares en la superficie celular se asocian con microvellosidades y no con cilios.

ACE2 y TMPRSS2 se localiza en la membrana plasmática excluyendo los cilios y esto coincide con los sitios de unión viral.  (A - C) Marcaje de anticuerpos de inmunofluorescencia contra ACE2 y TMPRSS2 usando anti-tubulina como marcador para cilios y faloidina para las microvellosidades enriquecidas en actina.  Se encontró que tanto ACE2 como TMPRSS2 estaban localizados en la superficie celular que incluía las microvellosidades.  Aunque existe una tinción difusa, probablemente inespecífica, en todas partes con el anticuerpo TMPRSS2, está claramente enriquecido en la membrana plasmática apical.  Las imágenes en escala de grises de los perfiles de tinción de ACE2 y TMPRSS2 muestran que solo se extienden una pequeña diferencia desde la superficie celular a diferencia de la tinción de tubulina de los cilios y se superponen con la tinción de faloidina.  (D) Un diagrama del patrón de tinción de los anticuerpos.  (E - G) Al mirar por TEM, los viriones (puntas de flecha rojas) se ven adheridos a microvellosidades (puntas de flecha negras) y no a los cilios (puntas de flecha blancas).  (H) Cuantificación del número de partículas virales unidas (dentro de los 3 nm) a microvellosidades y cilios, hay poca afinidad del virus por los cilios para los tres aislamientos.  La significación estadística se determinó mediante las pruebas t de Student (**** P = 0,0001).  Barras de escala (A - C) 10 µm y (E - G) 400 nm

ACE2 y TMPRSS2 se localiza en la membrana plasmática excluyendo los cilios y esto coincide con los sitios de unión viral. (A – C) Marcaje de anticuerpos de inmunofluorescencia contra ACE2 y TMPRSS2 usando anti-tubulina como marcador para cilios y faloidina para las microvellosidades enriquecidas en actina. Se encontró que tanto ACE2 como TMPRSS2 estaban localizados en la superficie celular que incluía las microvellosidades. Aunque existe una tinción difusa, probablemente inespecífica, en todas partes con el anticuerpo TMPRSS2, está claramente enriquecido en la membrana plasmática apical. Las imágenes en escala de grises de los perfiles de tinción de ACE2 y TMPRSS2 muestran que solo se extienden una pequeña diferencia desde la superficie celular a diferencia de la tinción de tubulina de los cilios y se superponen con la tinción de faloidina. (D) Un diagrama del patrón de tinción de los anticuerpos. (E – G) Al mirar por TEM, los viriones (puntas de flecha rojas) se ven adheridos a microvellosidades (puntas de flecha negras) y no a los cilios (puntas de flecha blancas). (H) Cuantificación del número de partículas virales unidas (dentro de los 3 nm) a microvellosidades y cilios, hay poca afinidad del virus por los cilios para los tres aislamientos. La significación estadística se determinó mediante las pruebas t de Student (**** P = 0,0001). Barras de escala (A – C) 10 µm y (E – G) 400 nm

Debido a que las CV se generan como resultado de la entrada y replicación virales exitosas dentro de las células huésped, los científicos usaron estos compartimentos como un marcador de infección celular. El análisis de microscopía electrónica identificó solo unas pocas CV en las células caliciformes en comparación con las de las células ciliadas. Estas observaciones revelan que las células caliciformes carecen de infección viral.

Para una mayor aclaración, los científicos examinaron la presencia de estructuras similares a proteínas en punta en la membrana celular como un marcador de infección. Los hallazgos revelaron que había protuberancias similares a proteínas en punta en las microvellosidades de las células ciliadas infectadas y no en las microvellosidades de las células caliciformes no infectadas. También se encontraron protuberancias similares en algunas partes de la membrana plasmática donde se unieron los viriones. Estas observaciones indican dos escenarios posibles: 1) después de la fusión de la membrana de la célula huésped y la envoltura viral, la proteína de la espiga queda en el parche de membrana fusionada; 2) después de expresarse en la célula huésped, la proteína espiga se transporta a la membrana plasmática.

Con respecto a la fusión viral, los hallazgos revelaron que la envoltura del virión estaba distendida y formaba una conexión continua con la membrana de la célula huésped. Se encontró que el contenido de nucleocápside del virión fusionado estaba diluido en comparación con los viriones completos presentes en la vecindad. Esta observación indica que algunas proteínas de la nucleocápside del virión fusionado ya han entrado en la célula huésped.

Con respecto a la gemación viral, se observó una estructura en forma de cuello en el sitio de fusión, lo que indica que el virión se está alejando en la dirección del lumen de la VC. Además, una imagen de una CV con dos viriones en ciernes mostró una red de microtúbulos que se dirigían hacia los viriones emergentes. Tal disposición estructural indica el transporte de componentes virales al sitio de gemación.

Importancia del estudio

El estudio proporciona información detallada sobre las características clave del ciclo de vida del SARS-CoV-2. Los detalles ultraestructurales de las células epiteliales infectadas por virus proporcionados en el estudio podrían ser potencialmente útiles para identificar dianas terapéuticas contra COVID-19.

*Noticia importante

bioRxiv publica informes científicos preliminares que no son revisados ​​por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, guiar la práctica clínica / comportamiento relacionado con la salud o tratarse como información establecida.

.



Source link