Novedoso proceso de calibración para microscopía de superresolución



La luz, y todas las olas, pueden doblarse en las esquinas de los obstáculos que se encuentran a lo largo de su camino. Debido a este fenómeno, llamado difracción, es imposible enfocar la luz en un punto que es menor que la mitad de su longitud de onda. En otras palabras, la resolución más alta que se puede lograr teóricamente usando un microscopio óptico es de aproximadamente 250 nm, una barrera llamada límite de difracción. Desafortunadamente, esta resolución no es suficiente para observar estructuras celulares finas, como las que se encuentran en las neuronas.

Durante más de un siglo, los microscopistas se vieron paralizados por esta barrera clásica hasta la invención de la microscopía de fluorescencia de superresolución. Un enfoque particularmente poderoso se desarrolló a fines de la década de 1990 y se acuñó la microscopía de agotamiento de emisiones estimuladas (STED). Esta técnica requiere que la muestra objetivo contenga fluoróforos, que son compuestos que absorben la luz en una longitud de onda y luego la reemiten en una más larga.

En la versión más simple de la microscopía STED, los fluoróforos se excitan en un punto circular mediante la irradiación con un láser enfocado de difracción limitada. Luego, una porción en forma de rosquilla alrededor del punto se irradia con luz menos energética, el rayo de agotamiento, que apaga la fluorescencia mediante el proceso de emisión estimulada. Por lo tanto, el efecto neto es que solo los fluoróforos en el centro de la rosquilla reemiten fotones, y debido a que esa área se puede hacer arbitrariamente pequeña, esto permite la microscopía de súper resolución.

Aunque la microscopía STED fue un verdadero avance para observar la morfología de las neuronas vivas a una resolución más alta, todavía hay margen de mejora. En un estudio reciente publicado en Neurofotónica, un equipo de científicos dirigido por el Dr. U. Valentin Nägerl de la Université de Bordeaux desarrolló un método de calibración simple pero efectivo que permite obtener imágenes STED más precisas a mayores profundidades de tejido. Su enfoque se basa en analizar y corregir una de las principales fuentes de error sistemático en microscopía STED para muestras biológicas: la aberración esférica del haz de agotamiento.

Cuando se toman imágenes de una muestra de tejido a profundidades superiores a 40 μm, el haz de agotamiento sufre varios tipos de desenfoque y degradación (aberración) y pierde su forma cuidadosamente elaborada, que es esencial para el método STED. La aberración esférica es el mayor infractor y fue el objetivo de los investigadores. Su estrategia consistía en preparar primero una muestra fantasma de tejido cerebral, un proxy basado en gel con un índice de refracción similar al del cerebro real. Esta muestra fantasma contenía fluoróforos y nanopartículas de oro dispersos homogéneamente, lo que permitió al equipo visualizar y cuantificar claramente cómo la forma del rayo de agotamiento se distorsionó a medida que penetraba más profundamente. Luego, calcularon los preajustes necesarios que se deben hacer al haz de agotamiento de acuerdo con la profundidad del tejido para que su forma final se asemeje más a la ideal. Los ajustes se realizaron utilizando la óptica adaptativa, que es una tecnología desarrollada originalmente por los astrónomos para mejorar las imágenes telescópicas que sufren aberraciones causadas por la atmósfera terrestre.

Una vez que se calibró la forma del rayo de agotamiento de acuerdo con las pruebas fantasma, los científicos procedieron a obtener imágenes de tejido neural vivo. Compararon los resultados de la microscopía STED regular, la microscopía STED corregida y la microscopía de dos fotones, una técnica que se ajusta específicamente para la obtención de imágenes de tejidos profundos. Los resultados fueron bastante convincentes: las imágenes STED corregidas capturaron los detalles finos de las dendritas neuronales más profundas mucho mejor que las imágenes STED estándar. “Utilizando nuestra estrategia de calibración, pudimos medir estructuras neuronales tan pequeñas como 80 nm a una profundidad de 90 μm dentro del tejido biológico y obtener un aumento de señal del 60 por ciento después de la corrección de la aberración esférica”, dice Nägerl.

Ji Yi, profesor de ingeniería biomédica en la Universidad Johns Hopkins, comenta: “La microscopía de superresolución se ha aplicado principalmente para muestras delgadas, como células de una sola capa, donde la dispersión de la luz es insignificante. El equipo dirigido por Valentin Nägerl implementó la óptica adaptativa en dos microscopía de reducción de emisión estimulada por fotones (2P-STED), y logró una resolución de 80 nm de las espinas dendríticas de neuronas de imagen a través de tejido cerebral de 90 micrones. Esto es digno de mención porque la superresolución es difícil de mantener en tejidos más gruesos, particularmente dada la alta calidad de dispersión de tejido cerebral.” Yi explica que el avance facilitará el estudio de las actividades e interacciones neuronales.

Teniendo en cuenta que este nuevo proceso de calibración es robusto, sencillo de implementar y relativamente económico, podría incorporarse fácilmente en las prácticas de laboratorio estándar para obtener mejores resultados con microscopios STED, siempre que la muestra fantasma preparada coincida con las propiedades ópticas de la muestra biológica. Al respecto, Nägerl afirma: “Nuestro enfoque no se limita a muestras de cerebro; podría adaptarse a otros tejidos con índices de refracción conocidos y relativamente homogéneos, así como a otros tipos de preparaciones, incluso potencialmente en el cerebro de ratón vivo intacto. “

Fuente:

Referencia de la revista:

Bancelin, S., et al. (2021) Corrección de aberraciones en microscopía de agotamiento de emisiones estimuladas para aumentar la profundidad de las imágenes en el tejido cerebral vivo. Neurofotónica. doi.org/10.1117/1.NPh.8.3.035001.

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