Nuevo inhibidor de la traducción del ARN del SARS-CoV-2

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A medida que continúa la búsqueda de inhibidores eficaces del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo agudo severo (SARS-CoV-2), un estudio reciente realizado por Facultad de Medicina de la Universidad de Yale investigadores publicados en el servidor de preimpresión bioRxiv* en octubre de 2020 informa sobre el efecto inhibidor del fármaco merofloxacina en el cambio de marco durante la replicación del SARS-CoV-2. Esta es una prueba de concepto importante que respalda el potencial de apuntar a −1 PRF como una terapia antiviral efectiva en esta pandemia, así como contra otros beta-coronavirus.

Traducción ORF1ab y desplazamiento de fotogramas

El SARS-CoV-2 se une a la célula huésped a través de su proteína de pico y comienza a replicarse para establecer la infección. La traducción de las proteínas virales comienza a partir del fragmento ORF1ab, que es con mucho el más grande, tiene más de 21 kb de longitud y comprende 2/3 de todo el genoma monocatenario.

Codifica una poliproteína, que luego se escinde en 16 proteínas no estructurales (nsp) por la acción de dos proteasas. Muchas proteínas de la segunda mitad de la poliproteína juegan un papel vital en la transcripción y replicación viral. Esto incluye nsp12, una ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp), ARN helicasa (Hel / nsp13) y una exoribonucleasa de corrección de pruebas, entre otras.

La traducción de ORF1b, el lado 3 ‘de ORF1ab, requiere que ocurra un cambio de marco en todos los coronavirus. Cuando los ribosomas llegan al final de ORF1a, algunos de ellos necesitan moverse en dirección retrógrada en un nucleótido. Este es el cambio de marco ribosómico programado -1 (-1 PRF).

Después de este cambio de marco, continúan traduciendo el resto del ORF en el nuevo marco de lectura -1 hasta que se ha traducido toda la poliproteína grande. De lo contrario, pronto llegarán a un codón de parada en el marco 0, lo que terminará la traducción prematuramente. Esto desactivará la replicación viral.

Una pantalla de alto rendimiento identifica los moduladores de PRF de SARS-CoV-2 −1.

Una pantalla de alto rendimiento identifica los moduladores de PRF de SARS-CoV-2 −1.

Estructuras FSE

Se encuentra a menudo que la región -1 PRF contiene una secuencia resbaladiza de 7 nucleótidos (UUUAAAC en SARS-CoV-2) y una estructura secundaria estable aguas abajo que funciona como un elemento estimulante del cambio de marco (FSE). Esto último provoca breves pausas en el movimiento hacia adelante del ribosoma, lo que permite que los ARNt logren el alineamiento correcto con respecto a la secuencia resbaladiza. Esto es en parte necesario para el cambio de marco ribosómico programado -1 (PRF).

Un FSE común es el pseudonudo de ARN. En el SARS-CoV, el SARS-CoV-2 y otros betacoronavirus, se cree que quizás un pseudonudo de tres tallos pueda actuar como FSE. Esta estructura no es muy común en los ARNm del hospedador. Por lo tanto, se usa a menudo para probar el efecto de interrumpir explícitamente la expresión de genes virales, como por mutaciones y medicamentos que inhiben -1 PRF.

Esto se ha demostrado en la replicación del VIH, tanto por un inhibidor de PRF -1 exógeno como por pistas que indican que es parte de la respuesta antiviral del huésped.

La merofloxacina inhibe la replicación del SARS-CoV-2

En el estudio actual, los investigadores identificaron el antibiótico fluoroquinolona merofloxacina mediante un cribado de alto rendimiento para los inhibidores -1 PRF del SARS-CoV-2. Muestran que la incubación con este compuesto suprimió la replicación del SARS-CoV-2 en las células Vero.

Aunque la ivermectina también era un inhibidor de PRF -1, tenía efectos de citotoxicidad, a diferencia de la merofloxacina, que solo tiene efectos citostáticos modestos incluso en niveles altos. Es un inhibidor específico del PRF del betacoronavirus -1, a diferencia de otras fluoroquinolonas que carecen de esta actividad. Esto sugiere que los grupos estructurales en ciertos sitios específicos pueden ser responsables de la inhibición del cambio de marco.

Dado que el FSE de la secuencia del SARS-CoV es casi idéntico al del SARS-CoV-2, la merofloxacina inhibe el cambio de marco 1 en ambos casi por igual. La concentración inhibitoria semimáxima (CI50) es ~ 20 μM, que es superior al 25% de inhibición producida por otro inhibidor llamado SHFL.

La merafloxacina es un inhibidor específico de los FSE de betacoronavirus, pero no de otros coronavirus u otros virus comunes. Otros coronavirus estacionales tienen una estructura de pseudonudo más elaborada, a diferencia del pseudonudo de 3 tallos de los betacoronavirus.

La inhibición de merofloxacina resiste mutaciones de escape

Los investigadores también encontraron que la inhibición del cambio de marco inducida por merofloxacina persiste a pesar de las mutaciones en el genoma viral. Se sabe que los virus de ARN tienen una tasa de mutación rápida, algunas de las cuales pueden hacer que el virus sea resistente al agente antivírico. El estudio incluyó mutaciones ya conocidas en el virus.

Encontraron muy pocas mutaciones en la secuencia FSE, lo cual es de esperar a la luz de la gran importancia de -1 PRF para la replicación viral. Entre las 20 mutaciones en esta región, no menos de 16 han ocurrido solo una vez. De los cuatro restantes, dos están en la raíz 1 y uno en la raíz 2 y 3.

Al estar en el tallo, ninguno de estos podría resultar en una alteración en la estructura de tres tallos del pseudonudo. Sin embargo, los investigadores encontraron que la inhibición de -1 PRF por merofloxacina ocurrió con todas estas variantes sin pérdida de eficacia.

Partiendo de estas mutaciones ya existentes que no cambiaron la estructura del pseudonudo, luego exploraron el efecto de otras mutaciones que perturbaban la estructura. Descubrieron que estos causaban una reducción en el cambio de fotograma del 10% al 77%, dependiendo de su interrupción. Una de las reducciones más significativas fue causada por una mutación en la uridina única no apareada, lo que indica que tiene una función desconocida. Tanto esta mutación, U13485, como el siguiente G13486 se conservan completamente entre los coronavirus humanos.

Aunque estas mutaciones generan una amplia gama de perturbaciones estructurales, la inhibición del cambio de marco producido por la merofloxacina que actúa sobre todas estas variantes se mantuvo casi igual. Esto indica que esta acción persiste y es poco probable que surjan mutaciones de escape.

La inhibición del cambio de marco impide la replicación del SARS-CoV-2

Luego, los investigadores examinaron el efecto del inhibidor sobre la replicación viral. Descubrieron que la merofloxacina inhibía la replicación a partir de la concentración más baja de 1,25 μM, a la que la concentración media máxima efectiva (CE50) era de 2,6 μM. Cuando la concentración del fármaco se elevó a 40 µM o más, el virus se volvió indetectable. La caída en el rendimiento viral estuvo casi exponencialmente relacionada con la inhibición de -1 PRF. Esto indica que la tasa de replicación del virus depende de la eficiencia del cambio de marco.

Implicaciones y direcciones futuras

Los FSE de los coronavirus son altamente eficientes, y este estudio explora la medida en que este atributo se relaciona con la viabilidad viral mediante el uso de un inhibidor de cambio de marco recientemente identificado. Los investigadores describen los resultados: “La relación casi exponencial entre el título viral y la eficiencia de -1 PRF apunta a un modelo simple en el que la traducción de ORF1b establece el límite de la tasa de crecimiento del SARS-CoV-2. “

Esto justifica el desarrollo de inhibidores de PRF -1 para antagonizar eficazmente el crecimiento de SARS-CoV-2 y otros virus de ARN del mismo tipo de PRF. Queda por realizar más investigación para dilucidar el mecanismo de inhibición de -1 PRF por la merofloxacina.

Otras posibles explicaciones

Los resultados también podrían explicarse por la necesidad absoluta de un PRF altamente eficiente para lograr la correlación estequiométrica correcta entre las enzimas del complejo de replicación. La pérdida de este equilibrio al reducir o aumentar la eficiencia de -1 PRF incluso un poco impacta severamente el crecimiento viral.

Otra posibilidad es que las pequeñas reducciones en cada una de las enzimas traducidas que limitan la velocidad del complejo replicasa-transcriptasa se acumulen para causar una reducción marcada en la replicación viral.

Podría deberse a la unión directa del FSE, perturbando la estabilidad del pseudonudo y disminuyendo así la pausa necesaria del ribosoma que se requiere para el cambio de marco. Otro punto de vista es que esta unión confiere estabilidad adicional al pseudonudo de modo que los ribosomas que llegan se atascan demasiado tiempo, chocan o tienen que hacer cola, todo lo cual perturba el proceso de elongación de la traducción suave.

Otras posibilidades incluyen la estabilización de una conformación FSE incorrecta, que excluye el cambio de marco. Estas estructuras se han demostrado recientemente en células infectadas por el virus. Si se encuentra que la merofloxacina interactúa con una o más de tales estructuras improductivas, podría reducir la eficiencia de FSE por la fracción más pequeña resultante de ARN productivos.

Finalmente, la merofloxacina puede actuar sobre los factores moduladores del hospedador que actúan sobre el desplazamiento inverso del marco de lectura, como las helicasas de ARN del hospedador, que pueden participar en el desarrollo del pseudonudo después del -1 PRF pero antes de la continuación de la traducción. Se sabe que las fluoroquinolonas se dirigen a las ADN topoisomerasas bacterianas. Un estudio adicional revelará las enzimas análogas en organismos superiores, incluidos los análogos de ARN.

*Noticia importante

bioRxiv publica informes científicos preliminares que no son revisados ​​por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, guiar la práctica clínica / comportamiento relacionado con la salud o tratarse como información establecida.

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