¿Son los inhibidores de la proteasa del SARS-CoV-2 antivirales efectivos en el tratamiento de COVID-19?


En la búsqueda de antivirales efectivos para prevenir y tratar la infección por coronavirus 2 (SARS-CoV-2) del síndrome respiratorio agudo severo, los científicos han investigado la posibilidad de inhibir la proteasa viral principal (Mpro) y la proteasa similar a la papaína (PLpro), que son clave para su replicación. Se han descrito muchos compuestos que inhiben estas enzimas y están avanzando a través de la vía de desarrollo de fármacos.

Sin embargo, un nuevo estudio, publicado en el bioRxiv* servidor en noviembre de 2020, llama la atención sobre las altas probabilidades de que estos no tengan actividad antiinfecciosa debido a las vías redundantes presentes en las células huésped humanas.

Estudio: Desafíos para atacar las proteasas del SARS-CoV-2 como estrategia terapéutica para COVID-19.  Haber de imagen: Alexyz3d / Shutterstock

Estas dos proteasas son cisteína proteasas, codificadas como proteína no estructural (nsp) 3 y nsp 5. De éstas, la Mpro se autoclea de una poliproteína grande y luego se dimeriza para formar la proteína funcional madura. Deben dividir la poliproteína viral grande en sus diversas partes funcionales para ayudar a establecer el complejo de transcripción-replicación cerca de los sitios de ensamblaje del virus dentro de las células huésped infectadas. Si se inhibe uno o ambos, se suprime el ARN viral y no se puede establecer la infección.

Se han identificado muchos inhibidores de Mpro, incluidos compuestos covalentes con ojivas electrofílicas, y uno ha entrado en ensayos clínicos en humanos. No ocurre lo mismo con el PLpro porque preferentemente se une a grandes sustratos de proteínas similares a la ubiquitina. Por tanto, los mejores inhibidores de PLpro parecen ser aquellos que se unen a los sitios no enzimáticos que reconocen la ubiquitina.

Problemas con los inhibidores de Mpro / PLpro

Los inhibidores de proteasa anteriores que se dirigen a otros virus de ARN han sido difíciles de desarrollar, y esto podría predecir obstáculos similares en el camino del intento actual. Por un lado, la autoescisión inicial de Mpro no se evita fácilmente, dado el perfil energético favorable de la reacción intramolecular.

En segundo lugar, el Mpro dimérico se agrega en ubicaciones específicas en el citosol o en las superficies de la membrana cerca de la poliproteína viral. Por tanto, los niveles de sustrato son bastante altos en la proximidad de la enzima, lo que hace poco probable la inhibición competitiva.

En tercer lugar, muchas proteasas virales tienden a mantener sus productos de escisión unidos dentro de los sitios de escisión del sustrato. Esto significa que son lentos para unirse al inhibidor a menos que el sustrato escindido se desplace primero, lo que se denomina inhibición del producto. Y Mpro tiene un sitio activo donde un inhibidor puede actuar solo después de que se forma su monómero, por lo que es imposible prevenir este paso.

En resumen, señalan los científicos, los únicos inhibidores posibles son aquellos que son altamente biodisponibles y pueden alcanzar concentraciones locales lo suficientemente altas como para inhibir competitivamente los sustratos originales y así lograr una inhibición temprana antes de que comience la replicación activa.

Reactividad cruzada de inhibidores de proteasa

De nuevo, los inhibidores de proteasa tienden a unirse a cualquier proteasa del huésped con un rango de sustrato preferido similar. La redundancia de las vías enzimáticas en la célula huésped es otro desafío. Se utiliza una variedad de sistemas celulares para estudiar estos inhibidores de plomo, lo que significa que expresan varias proteasas en diferentes niveles.

Por ejemplo, muchas proteasas pueden lograr la escisión de la proteína S del SARS-CoV-2 para facilitar la fusión viral, incluidas las cisteína catepsinas B y L, y TMPRSS2. Todos estos están presentes en niveles elevados en las células pulmonares, pero su expresión en líneas celulares experimentales varía. Esto significa que nadie sabe con certeza qué tipo de célula es en realidad el reflejo más preciso del sitio de infección primaria en un huésped vivo, y que puede que no sea posible apuntar a ninguno de ellos por separado, ya que los otros proporcionan una vía de escape.

Inhibidores de mpro desactivados por expresión de TMPRSS2

En el estudio actual, los investigadores seleccionaron seis compuestos covalentes con ojivas electrofílicas que inhibían la Mpro recombinante de manera dependiente del tiempo, de alrededor de 650 moléculas que se dirigen a los residuos de cisteína en Mpro y PLpro. No pudieron encontrar ninguna pista para el desarrollo de inhibidores de PLpro, tal vez debido a la muy estrecha gama de sustratos adecuados.

Dos de los seis parecían tener actividad antiviral por inhibición de Mpro en la línea celular de adenocarcinoma de pulmón modificado A549. Existe una diferencia significativa en la potencia en los ensayos de infección celular en comparación con in vitro pruebas, debido al efecto de la captación celular y la necesidad de inhibir completamente Mpro dentro de la célula huésped.

Sin embargo, cuando se probó en células que expresan TMPRSS2, su potencia observada se redujo drásticamente. El virus logró ingresar a la célula huésped a través de TMPRSS2, lo que indica que el supuesto inhibidor de Mpro en realidad solo logró inhibir la catepsina. Esta actividad se confirmó aún más.

Potencia de los aciertos de Mpro en ensayos de infección celular por SARS-CoV-2.  A) Dos de los seis inhibidores de Mpro recientemente identificados son activos en el modelo de infección A549 + ACE2.  B) Curvas de inhibición del SARS-CoV-2 de Remdesivir, E64d y K11777 en células A549 + ACE2 con o sin expresión de TMPRSS2.  C) Curvas de inhibición de SARS-CoV-2 de los inhibidores de Mpro JCP400 y JCP403 en células A549 + ACE2 con o sin expresión de TMPRSS2.  Los datos son medias ± DE de dos experimentos repetidos.

Potencia de los aciertos de Mpro en ensayos de infección celular por SARS-CoV-2. A) Dos de los seis inhibidores de Mpro recientemente identificados son activos en el modelo de infección A549 + ACE2. B) Curvas de inhibición del SARS-CoV-2 de Remdesivir, E64d y K11777 en células A549 + ACE2 con o sin expresión de TMPRSS2. C) Curvas de inhibición de SARS-CoV-2 de los inhibidores de Mpro JCP400 y JCP403 en células A549 + ACE2 con o sin expresión de TMPRSS2. Los datos son medias ± DE de dos experimentos repetidos.

Por lo tanto, estos compuestos principales se parecen a la cisteína conocida inhibidores de catepsina y se informó anteriormente de muchos inhibidores de Mpro, que también se encontró que eran inhibidores de las catepsinas en concentraciones nanomolares.

¿Cuáles son las implicaciones?

Los investigadores enfatizan que, aunque se están explorando muchos inhibidores potenciales de Mpro y PLpro para el tratamiento de la infección por SARS-CoV-2, es importante asegurarse de que estos compuestos sean realmente selectivos para estos objetivos enzimáticos, en lugar de inhibidores de otras vías celulares redundantes. Por ejemplo, rupintrivir, un supuesto inhibidor de Mpro, es un inhibidor de catepsina L muy potente, y esto explica la actividad antiviral observada.

En segundo lugar, la inhibición de la replicación viral no es un sustituto de la inhibición selectiva de la enzima diana, ya que la primera puede ocurrir también a través de otras vías. Esto último debe confirmarse directamente antes de que se pueda decir que una molécula de plomo tiene el eficacia. La capacidad de inhibir la catálisis de un sustrato de Mpro, o de marcar la enzima Mpro activa, es una métrica muy reciente para evaluar la actividad de Mpro dentro de una célula, de hecho.

En tercer lugar, las líneas celulares deben seleccionarse apropiadamente para probar la actividad antiviral a fin de permitir la identificación de inhibidores que actúan a través de vías de entrada viral redundantes.

Los autores resumen: “Creemos firmemente que nuestros hallazgos son de particular importancia a la luz de los medicamentos que se sugieren ampliamente para avanzar en ensayos clínicos como rupintrivir, o incluso que han entrado en ensayos clínicos como K11777 y PF-07304814”.

*Noticia importante

bioRxiv publica informes científicos preliminares que no son revisados ​​por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, guiar la práctica clínica / comportamiento relacionado con la salud o tratarse como información establecida.

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