Un nuevo enfoque de diagnóstico multiplexado para COVID-19


El síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2), responsable de la pandemia de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), es altamente transmutable e infeccioso. Para detectar adecuadamente las diferentes etapas de la infección viral, se requieren varios métodos de diagnóstico.

Un grupo de investigadores internacionales ha investigado la detección multiplexada de COVID-19 con tecnología de molécula única. El uso de un ensayo sin enzimas de una sola molécula para la detección multiplexada tiene varios beneficios, incluida la flexibilidad y la capacidad de cuantificar muestras de bajo volumen de manera eficaz. Los investigadores desarrollaron una plataforma para detectar el virus directamente de la muestra de un paciente, así como la respuesta inmune a través de anticuerpos como IgG e IgM.

Una versión preimpresa del trabajo de investigación está disponible en el medRxiv* servidor mientras el artículo se somete a revisión por pares.

Herramientas de diagnóstico actuales

Las pruebas de diagnóstico que se utilizan actualmente para las infecciones virales incluyen la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa en tiempo real (RT-PCR) y el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Estas pruebas requieren múltiples pasos e involucran una amplificación de señal basada en enzimas; el período de tiempo para estas pruebas de diagnóstico puede ser bastante largo, y esto puede hacer que su uso sea un poco incómodo durante una pandemia.

La pandemia ha requerido una dependencia de los sistemas de salud como nunca antes. Para garantizar que las personas estén seguras para regresar al trabajo o participar en otras actividades sociales después de presentar síntomas, se requieren pruebas de PCR de COVID-19 en grandes cantidades en un período corto de tiempo. Debido a esto, los nuevos métodos de diagnóstico pueden ser más efectivos durante una pandemia y en el manejo de una infección viral como el SARS-CoV-2.

Detección de molécula única de anticuerpos anti-RBD.  (A) Esquema de la prueba de diagnóstico serológico.  Las muestras de suero se incuban con antígeno viral conjugado con biotina (RBD) y se cargan en un cubreobjetos activado con estreptavidina recubierto con PEG.  Se añaden a la celda de flujo y se obtienen imágenes de varios anticuerpos anti-IgG humana (rojo) e IgM (azul claro) marcados con fluorescencia.  (B) Los anticuerpos anti-RBD humanos a las concentraciones indicadas se incubaron con biotina-RBD y se detectaron mediante anticuerpos IgG anti-humanos marcados con fluorescencia.  El LoD de anticuerpos se encuentra en concentraciones picomolares.  Ambos ejes están en escala logarítmica y el punto de datos sin anticuerpos anti-RBD no está a escala.  (C) Las muestras de suero de sujetos convalecientes o no infectados se diluyeron 1: 2500 y se analizaron como se describe en B para detectar la presencia de anticuerpos IgG anti-RBD en el suero de los sujetos.  El diagrama de caja muestra el número de puntos por campo de visión para todos los campos de visión fotografiados para cada muestra.  Los valores medios de cada grupo se compararon mediante la prueba t, valor p <0,05.  (D) Comparación entre la detección de una sola molécula y ELISA de anticuerpos anti-RBD.  Se realizaron imágenes de una sola molécula y ELISA contra anticuerpos anti-RBD en las mismas muestras.  Las señales de cada ensayo se normalizaron en comparación con las muestras de suero negativas.  La formación de imágenes de una sola molécula proporciona una mayor sensibilidad y rango dinámico en la detección de anticuerpos anti-RBD en suero.  (EF) El suero de sujetos con una enfermedad COVID-19 activa (azul), sujetos convalecientes (rojo) o no infectados (gris), se diluyó 1: 2500, se incubó con biotina-RBD y se cargó en una superficie recubierta de estreptavidrio.  Se obtuvieron imágenes y se cuantificaron anticuerpos anti-IgM (E) o IgG (F) humanos marcados con fluorescencia.

Detección de molécula única de anticuerpos anti-RBD. (A) Esquema de la prueba de diagnóstico serológico. Las muestras de suero se incuban con virus conjugados con biotina. antígeno (RBD) y se cargó en un cubreobjetos activado con estreptavidina recubierto de PEG. Se añaden a la celda de flujo y se obtienen imágenes de varios anticuerpos anti-IgG humana (rojo) e IgM (azul claro) marcados con fluorescencia. (B) Los anticuerpos anti-RBD humanos a las concentraciones indicadas se incubaron con biotina-RBD y se detectaron mediante anticuerpos IgG anti-humanos marcados con fluorescencia. El LoD de anticuerpos se encuentra en concentraciones picomolares. Ambos ejes están en escala logarítmica y el punto de datos sin anticuerpos anti-RBD no está a escala. (C) Las muestras de suero de sujetos convalecientes o no infectados se diluyeron 1: 2500 y se analizaron como se describe en B para detectar la presencia de anticuerpos IgG anti-RBD en el suero de los sujetos. El diagrama de caja muestra el número de puntos por campo de visión para todos los campos de visión fotografiados para cada muestra. Los valores medios de cada grupo se compararon mediante la prueba t, valor p <0,05. (D) Comparación entre la detección de una sola molécula y ELISA de anticuerpos anti-RBD. Se realizaron imágenes de una sola molécula y ELISA contra anticuerpos anti-RBD en las mismas muestras. Las señales de cada ensayo se normalizaron en comparación con las muestras de suero negativas. La formación de imágenes de una sola molécula proporciona una mayor sensibilidad y rango dinámico en la detección de anticuerpos anti-RBD en suero. (EF) El suero de sujetos con una enfermedad COVID-19 activa (azul), sujetos convalecientes (rojo) o no infectados (gris), se diluyó 1: 2500, se incubó con biotina-RBD y se cargó en una superficie recubierta de estreptavidrio. Se obtuvieron imágenes y se cuantificaron anticuerpos anti-IgM (E) o IgG (F) humanos marcados con fluorescencia.

Nuevos enfoques de diagnóstico

El desarrollo de métodos de diagnóstico novedosos ha aumentado en respuesta a las demandas costosas, de múltiples pasos y que consumen mucho tiempo dentro de los métodos de diagnóstico actuales. Los nuevos métodos de diagnóstico que se han desarrollado incluyen: transcripción inversa junto con detección de nanoporos, amplificación isotérmica, métodos basados ​​en CRISPR, enfoques basados ​​en secuenciación de próxima generación, así como investigación para mejorar la sincronización de RT-PCR a través del termociclado plasmónico.

Aunque estos nuevos métodos de diagnóstico tienen como objetivo mejorar el tiempo para las pruebas, así como el costo y la accesibilidad, todavía se basan principalmente en procesos enzimáticos.

Tecnología de imágenes de base única

La tecnología de imágenes de base única ha mejorado a lo largo de los años, pasando de tener una tecnología de secuenciación de mayor rendimiento a ser lo suficientemente sensible para detectar proteínas.

Junto con otros investigadores, los autores de este artículo han demostrado que la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) es capaz de detectar fluoróforos individuales adheridos a una superficie sólida al tiempo que proporciona multiplexación espacial y espectral y detección cuantitativa de moléculas.

Dentro de este trabajo de investigación, los científicos presentan una prueba de concepto para la captura superficial de estreptavidina-biotina, con marcaje fluorescente, con el fin de detectar ARN viral y anticuerpos séricos antivirales a través de imágenes de una sola molécula. Las pruebas en muestras mostraron que es probable que estos métodos de diagnóstico sean más eficientes que los métodos enzimáticos convencionales para detectar infecciones virales debido a su alta escalabilidad y dependencia mínima de las enzimas.

Los investigadores desarrollaron la detección de ARN por microscopía TIRF a través de los siguientes tres pasos. El primer paso incluye la hibridación en tubo, que consiste en la hibridación del ARN viral con dos tipos de sondas de ADN, incluidas las sondas marcadas con biotina y las sondas de detección marcadas con un fluoróforo.

El segundo paso es la inmovilización, donde las muestras se agregan a una celda de flujo con un cubreobjetos recubierto de estreptavidina, lo que permite que los complejos de hibridación sean capturados por la interacción biotina-estreptavidina.

El tercer y último paso incluye la obtención de imágenes, donde los complejos pueden ser captados por el microscopio TIRF, y este método permite que cada punto captado corresponda a una sola molécula de ARN viral.

Importancia para COVID-19

Usando tecnología de imágenes de base única, los investigadores desarrollaron un método para detectar ARN viral que podría usarse para detectar el virus SARS-CoV-2 en varias etapas de su ciclo de vida dentro del cuerpo. Los investigadores pudieron desarrollar un enfoque de tres pasos utilizando microscopía TIRF para obtener imágenes y detectar moléculas individuales de ARN viral.

Aunque el nuevo enfoque de diagnóstico detectó anticuerpos de forma más eficaz que el ensayo ELISA clásico, la sensibilidad de las hibridaciones de una sola molécula puede no ser tan eficaz como las pruebas de PCR basadas en amplificación. Sin embargo, al desarrollar el nuevo método con un mayor nivel de sensibilidad a través de huellas dactilares cinéticas de una sola molécula, esta limitación puede superarse.

Además de proporcionar una base de datos de sondas que se pueden utilizar para detectar SARS-CoV-2, el diseño es lo suficientemente flexible como para detectar patógenos adicionales.

Debido a la variedad de variantes que surgieron durante la reciente pandemia de COVID-19, esta prueba genética de molécula única ofrece el mayor potencial para la detección multiplexada de más de una variante.

*Noticia importante

medRxiv publica informes científicos preliminares que no son revisados ​​por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, guiar la práctica clínica / comportamiento relacionado con la salud o tratarse como información establecida.

Referencia de la revista:

  • Furth, N., Shilo, S., Cohen, N., Erez, N., Fedyuk, V., Schrager, A., Weinberger, A., Dror, A., Zigron, A., Shehadeh, M., Sela, E., Srouji, S., Amit, S., Levy, I., Segal, E., Dahan, R., Jones, D., Douek, D. y Shema, E., 2021. Detección multiplexada de COVID-19 con tecnología de molécula única, https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2021.05.25.21257501v1

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