Visualización del ARN del SARS-CoV-2 mediante sondas de hibridación fluorescentes in situ


Un equipo de científicos de Francia ha diseñado recientemente sondas de hibridación in situ de fluorescencia (CoronaFISH) para visualizar el ARN del coronavirus 2 (SARS-CoV-2) del síndrome respiratorio agudo severo en células infectadas. Una descripción detallada del diseño, validación y aplicación de la sonda está disponible actualmente en el bioRxiv* servidor de preimpresión.

Antecedentes

El síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2), el patógeno causante de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), es un virus de ARN monocatenario de sentido positivo envuelto que pertenece a la familia Coronaviridae. El segmento de ARN lineal único de SARS-CoV-2 sirve como molde para la transcripción y replicación viral. La ARN polimerasa dependiente de ARN del virus genera una hebra de sentido negativo, que se utiliza como plantilla para replicar genomas de ARN vírico de longitud completa y transcripción de ARN subgenómicos de cadena positiva (sgRNA). Posteriormente, las proteínas virales se sintetizan a partir de estos sgRNA y los viriones maduros se liberan de las células infectadas mediante exocitosis.

Para explorar la localización subcelular y la cinética de los virus de ARN en las células infectadas, es importante visualizar de manera directa y precisa el ARN viral en células individuales. En el estudio actual, los científicos han diseñado y validado sondas CoronaFISH de molécula única contra las cadenas de ARN positivas y negativas del SARS-CoV-2. Han usado estas sondas para visualizar ARN viral en células aisladas de mono verde africano, líneas celulares humanas, muestras de pacientes con COVID-19 y tejidos humanos.

Visualización del SARS-CoV-2 con CoronaFISH (a) Principio de CoronaFISH.  96 sondas primarias se hibridan previamente in vitro con sondas secundarias portadoras de colorante mediante la secuencia FLAP.  Los dúplex resultantes se hibridan posteriormente en células para dirigirse al ARN positivo o negativo de SARS-CoV-2.  (b) Ciclo de replicación del SARS-CoV-2.  El ARN genómico de cadena positiva entrante se utiliza para producir polimerasa viral.  La polimerasa produce un intermedio de replicación de hebra negativa, que sirve como plantilla para la síntesis de ARN subgenómicos de hebra positiva completa y más cortos.  Estos últimos se utilizan para producir otras proteínas virales.  (c) Genoma de SARS-CoV-2 con posiciones de sonda indicadas dirigidas a la hebra positiva y negativa.  (d) Imágenes de células Vero no infectadas e infectadas con las hebras positivas o negativas detectadas con sondas marcadas con Cy3.  Se muestran acercamientos en celdas individuales.  Imágenes de tamaño completo en la Fig. S1a.  La primera columna muestra el control no infectado, la segunda y la tercera columna células infectadas con diferentes escalas de intensidad como se indica entre paréntesis (los valores primero y segundo entre paréntesis indican los valores de píxeles correspondientes a las intensidades más bajas y más brillantes en la imagen mostrada, respectivamente).  Barras de escala de 5 μm.  Barra de escala en rojo recuadro 1 μm.  (e) Cuantificación de intensidades de señal en células individuales.  La línea discontinua es el cuantil del 99% estimado a partir de muestras no infectadas.  (f) Imágenes simultáneas de hebras positivas y negativas con CoronaFISH de dos colores.  Barra de escala en imagen completa de 10 μm, en recuadro de 2 μm.  (g) Imágenes de células tratadas con Remdesivir (derecha) o células sin tratar (izquierda).  Barras de escala de 30 μm.  (h) La cuantificación de las células tratadas con Remdesivir se realizó como en e).

Visualización del SARS-CoV-2 con CoronaFISH (a) Principio de CoronaFISH. 96 sondas primarias se hibridan previamente in vitro con sondas secundarias portadoras de colorante mediante la secuencia FLAP. Los dúplex resultantes se hibridan posteriormente en células para dirigirse al ARN positivo o negativo de SARS-CoV-2. (b) Ciclo de replicación del SARS-CoV-2. El ARN genómico de cadena positiva entrante se utiliza para producir polimerasa viral. La polimerasa produce un intermedio de replicación de hebra negativa, que sirve como plantilla para la síntesis de ARN subgenómicos de hebra positiva completa y más cortos. Estos últimos se utilizan para producir otras proteínas virales. (c) Genoma de SARS-CoV-2 con posiciones de sonda indicadas dirigidas a la hebra positiva y negativa. (d) Imágenes de células Vero no infectadas e infectadas con las hebras positivas o negativas detectadas con sondas marcadas con Cy3. Se muestran acercamientos en celdas individuales. Imágenes de tamaño completo en la Fig. S1a. La primera columna muestra el control no infectado, la segunda y la tercera columna células infectadas con diferentes escalas de intensidad como se indica entre paréntesis (los valores primero y segundo entre paréntesis indican los valores de píxeles correspondientes a las intensidades más bajas y más brillantes en la imagen mostrada, respectivamente). Barras de escala de 5 μm. Barra de escala en rojo recuadro 1 μm. (e) Cuantificación de intensidades de señal en células individuales. La línea discontinua es el cuantil del 99% estimado a partir de muestras no infectadas. (f) Imágenes simultáneas de hebras positivas y negativas con CoronaFISH de dos colores. Barra de escala en imagen completa de 10 μm, en recuadro de 2 μm. (g) Imágenes de células tratadas con Remdesivir (derecha) o células sin tratar (izquierda). Barras de escala de 30 μm. (h) La cuantificación de las células tratadas con Remdesivir se realizó como en e).

Observaciones importantes

Para visualizar el ARN del SARS-CoV-2 en células infectadas, los científicos utilizaron sondas de hebra positiva y negativa marcadas con fluoróforo Cy3. Observaron solo una señal fluorescente débil y difusa en las células no infectadas, mientras que en las células infectadas observaron una señal muy fuerte y localizada en el citoplasma. La fuerte señal de ARN observada en el citoplasma apoya el ciclo de replicación citoplasmática del SARS-CoV-2. Los científicos creen que debido a que las sondas están diseñadas para cubrir toda la longitud del ARN viral (aproximadamente 30 kb), la intensidad de la señal no debería verse afectada por mutaciones virales o degradación parcial del ARN.

El análisis cuantitativo de la intensidad de la señal reveló que las sondas de cadena positiva generaban señales de intensidad significativamente más altas que las sondas de cadena negativa, lo que justifica una menor cantidad de intermedios de replicación de ARN de cadena negativa en las células infectadas.

Usando imágenes de dos colores, los científicos demostraron que estas sondas FISH pueden visualizar ARN virales de cadena positiva y negativa simultáneamente. Para este experimento, etiquetaron las sondas con dos fluoróforos diferentes (Atto488 y Cy5). Las imágenes que obtuvieron usando estas sondas mostraron claramente ARN de cadena positiva y negativa en las mismas células infectadas y en las mismas ubicaciones subcelulares. El proceso de visualización simultánea de ARN positivos y negativos se puede utilizar potencialmente para estudiar la dinámica intracelular de la transcripción y replicación viral.

Los experimentos realizados con hisopos nasales de pacientes con COVID-19 revelaron que las sondas específicas para el ARN viral de cadena positiva producían una señal fuerte en un subconjunto de células. Además, un conjunto separado de experimentos reveló que las sondas FISH podrían detectar ARN viral en líneas celulares humanas y muestras de tejido humano recolectadas de pacientes con COVID-19.

Importancia del estudio

Según los científicos, las sondas CoronaFISH que diseñaron tienen varias ventajas sobre la técnica de inmunofluorescencia. En lugar de marcar proteínas virales, estas sondas pueden visualizar directamente el genoma viral, lo que es beneficioso en términos de examinar específicamente la presencia del virus y su proceso de replicación en ubicaciones subcelulares específicas. De esta manera, es posible diferenciar entre la infección primaria por SARS-CoV-2 (infección productiva) y la infección secundaria inducida por el tratamiento (infección no productiva).

CoronaFISH puede proporcionar información detallada sobre la presencia y abundancia de ARN viral en las células infectadas, la localización subcelular del ARN viral y la dinámica de interacción huésped-virus a nivel molecular. Además, las sondas se pueden modificar para la visualización microscópica electrónica del ARN del SARS-CoV-2.

Otra ventaja de CoronaFISH son las secuencias complementarias únicas entre las sondas y el virus, lo que permite distinguir el SARS-CoV-2 de otras cepas virales. Además, las sondas se pueden preparar de forma rápida y rentable, lo que convierte a CoronaFISH en una opción atractiva para el cribado de compuestos terapéuticos basado en imágenes de alto rendimiento.

*Noticia importante

bioRxiv publica informes científicos preliminares que no son revisados ​​por pares y, por lo tanto, no deben considerarse concluyentes, guiar la práctica clínica / comportamiento relacionado con la salud o tratarse como información establecida.

Referencia de la revista:

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